الشرطي ضربة قاضية للتعبير الجيني في خطوط خلايا السرطان لدراسة توظيف حيدات/الضامة إلى ورم المكروية
نوفمبر 23, 2017
هذا البروتوكول يعمل كمخطط لإقامة نظام على تيت وظيفية في خطوط خلايا السرطان واستخدامها لاحقاً، لا سيما لدراسة دور البروتينات المشتقة من خلية الورم في تجنيد حيدات/الضامة إلى ورم المكروية.
يتمثل هذا البروتوكول بشكل عام في استخدام الضربة القاضية المشروطة للتعبير الجيني في الخلايا السرطانية لدراسة تجنيد الخلايا الوحيدة والضامة في البيئة المكروية للورم في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيئة المكروية للورم فيما يتعلق بطبيعة المخزون المتقاطع بين الخلايا السرطانية وخلايا الجهاز المناعي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن النظام المستخدم هنا يتطلب استنساخا متجها أحادي التوجيه ، ويسمح بالتوليد السريع للنسخ المتعددة ، ويظهر مستويات منخفضة جدا من السماكة.
كما تم توضيح طريقة لتنقية الخلايا الوحيدة البشرية دون الاتصال المباشر بالأجسام المضادة والتي تتجنب التنشيط العرضي بينما تؤدي إلى أكثر من 95٪ من السكان الوحيدات البشرية. لإنتاج جزيئات فيروسية ، قم بنقل أطباق متجمعة بنسبة 70٪ 150 ملم من خلايا HEK-293 مع 25 ميكروغراما من pLKO-tet-on shRNA ، و 25 ميكروغراما من بلازميد تغليف psPAX ، وخمسة ميكروغرامات من البلازميد pMD2 الذي يعبر عن المغلف. G باستخدام كاشف الإرسال وفقا للبروتوكولات القياسية.
أضف المزيج إلى أطباق 150 ملم. في اليوم التالي ، قم بتحفيز إنتاج الفيروسات العدسية في الخلايا عن طريق تغيير الوسط إلى DMEM المكمل ب 10 مللي مولار من زبدات الصوديوم و 20 مليمولر هيبيس. استزراع لمدة ثماني ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ثماني ساعات ، اغسل الخلايا باستخدام PBS وأضف 25 مل من وسط DMEM الطازج مع 20 ملليمولار HEPES وبدون زبدات الصوديوم. بعد الحضانة لمدة 48 ساعة ، اجمع الوسط المحتوي على الفيروس بعناية باستخدام ماصة. لتوليد خطوط خلوية مستقرة ، ابدأ بزرع خلايا سرطان القولون HCT-116 وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 في صفيحة مكونة من 12 بئرا و 50،000 خلية لكل بئر.
احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 60-70٪ ، اغسل الخلايا باستخدام PBS وأضف ملليلترا واحدا من الوسط المحتوي على الفيروسات إلى كل بئر. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسط المحتوي على الفيروس بعناية عن طريق الشفط.
ثم بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ، أضف وسيطا يحتوي على FBS خال من التتراسيكلين. بعد 72 ساعة ، اغسل الخلايا كما كان من قبل وأضف وسيطا مكملا بميكروغرام واحد لكل مليلتر بورومايسين لاختيار الخلايا المنقولة بالفيروسات. حدد الخلايا المنقولة بالفيروسات عن طريق زراعة الخلايا في وجود بورومايسين لمدة ثلاثة إلى 14 يوما.
لاحظ القتل الجزئي للآبار بواسطة بورومايسين في الخلايا ذات الخلايا المنقولة بالفيروسات. لن تنمو الخلايا غير المنقولة في وجود بورومايسين. عندما تموت خلايا التحكم هذه ، استمر في زراعة خطوط الخلايا المنظمة بشكل مشروط لمدة أسبوعين في وجود المضادات الحيوية لإنشاء خطوط الخلايا المنظمة بشروط.
التحقق من كفاءة الضربة القاضية المشروطة في سرطان القولون HCT-116 المقاوم للبورومايسين وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 عن طريق إضافة وسط بتركيزات مختلفة من الدوكسيسيكلين وزراعة الخلايا لمدة 72 ساعة. بعد تحضير محللة الخلية ، تحقق من مستوى الضربة القاضية عن طريق تحليل اللطخة الغربية. يتم عرض مستويات PAI-1 هنا.
لعزل الخلايا الوحيدة في الدم المحيطي ، قم أولا بإعداد ثلاثة أنابيب سعة 50 مليلتر تحتوي على 15 مل من محلول تدرج الكثافة. ثم استخدم وحدة تحكم ماصة مضبوطة على تدفق الجاذبية لوضع طبقة ببطء 30 مل من الدم المخفف فوق محلول تدرج الكثافة. جهاز طرد مركزي في دوار متأرجح عند 400 جم في درجة حرارة الغرفة دون انقطاع لمدة 25 دقيقة.
بعد الطرد المركزي ، تخلص من الطبقة العليا وانقل الطبقة الوسطى التي تحتوي على خلايا الدم المحيطية أحادية النواة إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر وأضف FBS المكمل ب PBS حتى 50 ملليلترا. جهاز طرد مركزي عند 120 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة المطفية المحتوية على الصفائح الدموية.
بعد الطرد المركزي النهائي والتجميع ، قم بتعليق الحبيبات في 50 مل من FBS المكملة ب PBS وعد خلايا الدم المحيطية أحادية النواة باستخدام مقياس كثافة الدم. بعد الطرد المركزي للخلايا عند 120 جم ، أعد تعليق الحبيبات في FBS المكملة ب PBS التي تحتوي على EDTA واحد مليمولار إلى تركيز نهائي يبلغ 50 مليون خلية لكل مليلتر. ثم ابدأ في إثراء الخلايا الوحيدة عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة للاختيار السلبي لكل مليلتر من تعليق الخلية وخلطها.
احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل مليلتر ، واخلطه واحتضنه لمدة 10 دقائق أخرى. ثم أضف PBS مع FBS و EDTA حتى 25 مل وضع خليط الدم المحيطي أحادي النواة في مغناطيس يمكن أن يستوعب أنبوب 50 ملليلترا.
بعد الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ستلتصق الخرزات المغناطيسية بجدران الأنبوب وتعزل الخلايا غير أحادية الخلية عن المحلول. استخدم ماصة سعة 25 ملليلتر لإزالة محلول يحتوي على خلايا وحيدة من الأنبوب مع الحرص على عدم لمس جوانب الأنبوب بالماصة. بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، قم بإعادة تعليق الحبيبات التي تحتوي على خلايا وحيدة في وسط RPMI يحتوي على 10٪ FBS خال من TET و 1٪ بقلم عقدي.
ابدأ الاختبار عن طريق بذر 40،000 خلية HCT-116 أو MDA-MB-231 بحجم 0.5 مليلتر في آبار صفيحة 24 بئرا بثلاث نسخ. في اليوم التالي ، أضف مرشحا إلى البئر. ثم ضع 8 ، 000 خلية وحيدة بحجم 0.3 مليلتر على غشاء مسامي معالج ب BSA يوضع في الجزء العلوي من الخلايا السرطانية ويحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
اجمع الإدخالات بعد 48 ساعة. تخلص من الوسط الزائد واسحب السطح الداخلي بدقة باستخدام قضيب قطني لإزالة الخلايا التي لم تهاجر. قم بتلطيخ الجانب الخارجي من الملحق باستخدام طريقة Wright-Giemsa.
بعد تركيب المرشحات مع وضع جانب البلاعم المنتقل لأعلى ، قم بتصوير الشرائح باستخدام مجهر ضوئي بهدف 20 قوة. التقط صورا لتسعة حقول لكل عامل تصفية وحساب البلاعم التي تم ترحيلها في جميع الحقول. تم استخدام اختبار غرفة بويدن لتحديد هجرة الخلايا الوحيدة نحو الخلايا السرطانية.
في وجود خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 ، تم تثبيط هجرة الخلايا الوحيدة بنسبة 33٪ بعد إضافة الدوكسيسيكلين إلى الثقافة المشتركة لتقليل تنظيم PAI-1. كان هذا التثبيط لهجرة الخلايا الوحيدة أكثر وضوحا في وجود خلايا سرطان القولون HCT-116 حيث أدى الضربة القاضية ل PAI-1 عن طريق إعطاء الدوكسيسيكلين إلى تقليل هجرة الخلايا الوحيدة بنسبة 74٪ لوحظت نتائج مماثلة عندما تم وضع الظروف المتوسطة للخلايا السرطانية المعالجة بالدوكسيسيكلين في قاع الآبار كمصدر للجاذبات الكيميائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نظام tet-on وظيفي للضربة القاضية للتعبير الجيني في خطوط الخلايا السرطانية البشرية لدراسة تأثير الجاذب الكيميائي للبروتين المفرز المشتق من السرطان PAI-1 على الخلايا الوحيدة البشرية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول نظام Tet-ON وظيفي لخطوط خلايا السرطان، مع التركيز على دور البروتينات المشتقة من الخلايا السرطانية في تجنيد الخلايا الوحيدة/الماكروفات إلى البيئة الدقيقة للورم.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- علم المناعة
- بحوث السرطان
الخلفية
- فهم التفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية أمر بالغ الأهمية لأبحاث السرطان.
- تلعب الخلايا الوحيدة والماكروفات أدوارًا مهمة في البيئة الدقيقة للورم.
- يمكن أن توفر تقنيات الحذف الشرطي رؤى حول هذه التفاعلات.
- طرق تنقية الخلايا الوحيدة البشرية ضرورية لإجراء دراسات دقيقة.
هدف الدراسة
- التحقيق في آليات تجنيد الخلايا المناعية للأورام.
- استخدام نظام Tet-ON للتعبير الجيني الشرطي في الخلايا السرطانية.
- تعزيز فهم تفاعلات الخلايا السرطانية والمناعية.
الطرق المستخدمة
- الحذف الشرطي للتعبير الجيني في الخلايا السرطانية.
- استنساخ ناقل واحد لتوليد سريع لمجموعات متعددة.
- تنقية الخلايا الوحيدة البشرية بدون تلامس مع الأجسام المضادة.
- نقل خلايا HEK-293 لإنتاج جزيئات فيروسية.
النتائج الرئيسية
- نجح في إنشاء نظام Tet-ON في خطوط خلايا السرطان.
- حققت نسبة نقاء تزيد عن 95٪ في مجموعات الخلايا الوحيدة البشرية.
- أظهرت تجنيدًا فعالًا للخلايا المناعية في المختبر.
- قدمت رؤى حول ديناميكيات البيئة الدقيقة للورم.
الاستنتاجات
- يعتبر نظام Tet-ON أداة قيمة لدراسة التفاعلات بين السرطان والمناعة.
- يمكن أن توضح تقنيات الحذف الشرطي دور الجينات المحددة.
- يمكن أن يساعد فهم تجنيد الخلايا الوحيدة في توجيه الاستراتيجيات العلاجية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Conditional gene knockdown in cancer cell lines enables mechanistic interrogation of tumor-immune interactions, specifically the role of secreted factors like PAI-1 in monocyte recruitment. This approach supports target validation by allowing time-dependent modulation of gene expression to avoid lethal phenotypes and assess functional contributions to the tumor microenvironment. The method provides predictive confidence in de-risking immunomodulatory targets by linking gene suppression to measurable immune cell migration in vitro.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by conditionally regulating gene expression to assess impact on monocyte recruitment without confounding cytotoxic effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through inducible knockdown that clarifies pathway involvement in tumor-immune crosstalk.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by linking gene suppression to reduced monocyte migration, informing go/no-go decisions in immunomodulatory programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated cancer cell lines with inducible shRNA expression for consistent, reproducible assessment of chemoattractant activity.
- Operational Value: Enables standardization of monocyte migration assays using purified primary cells and Boyden chamber readouts for quantitative comparison across conditions.
- Scalability: Facilitates platform reuse across cancer models (e.g., HCT-116, MDA-MB-231) and secreted factors beyond PAI-1.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical work by modeling human tumor-monocyte interactions in a controlled, reproducible system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether secreted proteins act as direct chemoattractants, reducing ambiguity in biomarker or target prioritization.
- Predictive Continuity: Supports risk-adjusted advancement by providing functional data on immune modulation before in vivo validation.
Pipeline & Workflow Integration
The Tet-ON conditional knockdown system fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling iterative testing of immunomodulatory mechanisms in physiologically relevant cancer cell models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing temporal control of gene expression to dissect dynamic tumor-stroma interactions.
- Screening: Delivers assay-ready, inducible cell lines that produce quantifiable outputs (e.g., migrated macrophage counts) for compound or genetic perturbation screening.
- Analytics: Generates measurable dependent variables (monocyte migration inhibition %) that enable statistical comparison between control and knockdown conditions.
- Translational Research: Models human-relevant tumor microenvironment dynamics using primary monocytes and cancer cell lines, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for studying various secreted factors in immune recruitment, adaptable across oncology indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-immunology studies by enabling conditional, reversible gene suppression.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized viral transduction, selection, and induction protocols across cell lines.
- Strategic Value: Improves target prioritization by providing functional evidence of gene contribution to immune evasion or infiltration.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted resource allocation by validating targets whose modulation alters monocyte behavior in vitro.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral vector production, cell culture, and antibiotic selection for stable line generation.
- Dependent on transfection efficiency and viral titer for consistent transduction in cancer cell lines.
- Necessitates validation of knockdown efficiency via Western blot or qPCR post-induction to confirm on-target effects.
- Requires optimization of doxycycline concentration and timing to avoid leaky expression or cytotoxicity.
- Relies on aseptic technique and density gradient centrifugation for high-purity monocyte isolation without activation.
