عزل وتوصيف المجهرية الدقيقة المستمدة من العَدلات للدراسات الفنية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو عزل وتوصيف الجسيمات الدقيقة المشتقة من العدلات للدراسات الوظيفية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول دور حويصلات الخلايا الخارجية ، أو الجسيمات الدقيقة ، في التواصل بين الخلية والخلية في العمليات الفسيولوجية المختلفة بما في ذلك السرطان والالتهاب والتئام الجروح. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها سريعة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة ، وأنها تسمح بتقييم التركيب النموذجي للجسيمات الدقيقة ، أو الحويصلات الدقيقة ، في الأصول الوظيفية.

سيوضح الإجراء أرييل فينكيلشتاين ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري ، وجوزيف لي ، طالب جامعي في مختبري. لفصل التدرج الكثافة لنخاع عظم الفئران متعدد الأشكال ، أو خلايا PMN ، قم أولا بطبقة ببطء ثلاثة ملليلتر من محلول محضر طازجا ، بدرجة حرارة الغرفة ، 1.077 جرام لكل مليلتر على ثلاثة ملليلتر من محلول كثافة محضر طازجا ، بدرجة حرارة الغرفة ، 1.119 جرام لكل مليلتر في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مليلتر لكل عينات من خلايا نخاع العظم. بعد ذلك ، قم بتراكب مليلتر واحد من خلايا نخاع العظم المعزولة حديثا في PBS البارد على طبقة التدرج العليا لكل أنبوب ، وافصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة.

في نهاية الفصل ، قم بإزالة طبقات الخلية أحادية النواة بعناية في الواجهات بين PBS وطبقات التدرج عالي الكثافة في كل أنبوب دون إزعاج نطاقات PMN. باستخدام ماصة النقل ، اجمع طبقات PMN في أنبوب واحد جديد سعة 15 مليلتر لكل عينة ، ورفع الحجم النهائي في كل أنبوب إلى 15 مل مع PBS مفلتر بحجم 0.1 ميكرون. قم بتحطيير PMNs عن طريق الطرد المركزي ، متبوعا بالطرد المركزي الثاني في ملليلترين من PBS المصفى حديثا لكل أنبوب.

ثم أعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من PBS المصفى حديثا للعد. بعد العد ، قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من HBSS المصفى بحجم 0.1 ميكرون ، مع استكمال المنشط ذي الأهمية لكل 10 ملايين خلية. احتضن لمدة 20 إلى 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

في نهاية التحفيز ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وانقل المواد الطافية الخالية من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد 1.5 ملم لكل عينة. قم بالطرد المركزي للطافية لإزالة أي بقايا خلية ، ونقل المواد الطافية التي تم تطهيرها إلى أنابيب جديدة فائقة الطرد المركزي ، ثم الطرد المركزي الفائق للطاقات ، وتخزين الجسيمات الدقيقة المحببة في أنابيب طرد مركزي فائقة الغلق بالبارافين عند 80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل التجريبي. لإدارة الجسيمات الدقيقة في القولون الفأر ، ضع أولا فأر مخدر بالكامل في وضع الانبطاح ، واستخدم ملقط الخزعة ومنظار داخلي مزود بكاميرا عالية الدقة لتوليد ثلاثة إلى خمسة جروح سطحية على طول الجانب الظهري من القولون.

أعد الفأر إلى قفصه مع المراقبة حتى الشفاء التام. بعد 24 ساعة ، استخدم المنظار للحصول على صور للجروح التي لحقت تحت التخدير. ثم استخدم نظام الحقن الدقيق القائم على تنظير القولون لإدارة حجم تجريبي من الجسيمات الدقيقة PMN المعاد تعليقها في 100 ميكرولتر من HBSS مباشرة في كل موقع جرح.

يمكن تقييم عدم تجانس حجم الجسيمات الدقيقة PMN من خلال مقارنة الجسيمات الدقيقة بخرز قياس التدفق الخلوي المعروف الحجم. كما هو موضح ، يمكن أيضا فحص التعبير عن البروتينات ذات الأهمية بواسطة الجسيمات الدقيقة عن طريق قياس التدفق الخلوي. في هذه التجربة ، تم تقييم التعبير عن الجزيئات الرئيسية للالتهابات والمضادة للالتهابات بواسطة الجسيمات الدقيقة المشتقة من PMN المحفزة بالمنشط بواسطة اللطخة المناعية.

يمكن مراقبة تأثيرات الجسيمات الدقيقة PMN على التئام الخلايا الظهارية عن طريق الحصول على صورة للطبقات الظهارية الأحادية المصابة بالخدش في نقاط زمنية محددة مسبقا في المختبر ، وكذلك بعد جرح ملقط الخزعة في الجسم الحي. بمجرد إتقان الجسيمات الدقيقة المشتقة من PMN ، يمكن عزلها في غضون أربع ساعات ، إذا تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه قبل التحفيز ، يجب إبقاء PMN على الجليد لمنع التنشيط المبكر وفقدان الجسيمات الدقيقة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي ، والتنشيف المناعي ، وتفاعل الانتشار في الوقت الفعلي لتحديد محتوى الجسيمات الدقيقة ، في ظل ظروف تحفيزية مختلفة ، أو من خلايا أصلية مختلفة. هذه التقنية مفيدة لفحص دور مساهمة الجسيمات الدقيقة في تنظيم الاستجابات المناعية ، ووظيفة الحاجز ، وإصابة الأنسجة وإصلاحها ، وكذلك في تطور السرطان. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الجسيمات الدقيقة للفئران وتسميتها واستخدام الجسيمات الدقيقة في أصل وظيفي لالتئام الجروح في الجسم الحي.

لا تنس أن العمل مع الحية يمكن أن يكون خطيرا ، وأن الاحتياطات تشير إلى ارتداء معدات الحماية الشخصية واستكمال تدريبات السلامة المناسبة يجب دائما القيام بها قبل تنفيذ هذا الإجراء.