العدلة عزل بروتوكول
يوليو 23, 2008
العدلات هي من بين الخلايا الأولى للوصول في موقع رد الفعل المناعي للالتهابات ، وخضعت للدراسة وظائفها وآليات على نطاق واسع في المختبر. نظهر متدرجة الكثافة الطريقة المعيارية الفصل لعزل العدلات الإنسان من الدم الكامل باستخدام وسائل الإعلام فصل متاحة تجاريا.
بروتوكول عزل العدلات. سيقوم هذا الإجراء باستخراج خلايا الدم البيضاء من أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لعينة الدم الكاملة. دوامة سيدي إبرة وفلتر حقنة حقنة.
ملي صب العلامة التجارية MX gv 0.22 ميكرومتر المواد. يتطلب فصل العدلات لتعويذة هانك ومحلول الملح نوعين من حلول HBSS. سيتم استخدام HBSS مع كلوريد الكالسيوم لعمل محلول مع زلال مصل البشرية.
سيتم استخدام HBSS بدون كلوريد الكالسيوم لتعليق وغسل العدلات. يرجى توخي الحذر بشكل خاص لاستخدام محلول HBSS المناسب في هذا الإجراء. ألبومين مصل الدم البشري أو HSA هو بروتين في بلازما الدم يحافظ على درجة الحموضة وضغط SMO.
لا تستخدم المخزن المؤقت لتحلل الخلايا الحمراء المدمج في مصل الأبقار. يتم تصنيعها بواسطة Roche Diagnostics و neutrophil Isolation Media NIM Cedar Line Labs وسائط فصل بولي خفيفة ليمفاوية محمية من الضوء ومحفوظة في الثلاجة للحصول على أفضل النتائج. يجب أن تكون جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة وقت الاستخدام.
قم بإزالة الكواشف من الثلاجة قبل ساعة واحدة من التجربة. تحضير محلول H-B-S-S-H-S-A لفصل العدلات. ماصة HBSS مع كلوريد الكالسيوم في قارورة.
ارسم HSA في المحقنة. تجنب حبس فقاعات الهواء. قم بإزالة إبرة المحقنة واستبدلها بالفلتر.
حقن HSA من خلال مرشح في دوامة قارورة HBSS اثنين عندما يكون لديك المواد الأخرى جاهزة وفي درجة حرارة الغرفة ، احصل على حوالي 15 مل من الدم الكامل. سينتج عن ذلك 10 إلى 15 مل من 10 إلى العدلات الثامنة. يجب ألا يكون المتبرع قد تناول الكحول أو المخدرات التي لا تستلزم وصفة طبية لمدة 24 ساعة قبل التبرع بعينة الدم.
يمكن أن تعطل هذه عملية الانفصال. يمكن مضاد تخثر الدم الكامل باستخدام سترات EDTA أو الهيبارين عن طريق إضافة تسعة أجزاء من الدم إلى جزء واحد K أو ثلاثة سترات الصوديوم EDTA أو الهيبارين باتباع تعليمات الشركة المصنعة. سيتم وصف الخطوات التالية في هذا الإجراء.
فصل وإزالة البلازما والخلايا الوحيدة. فصل واكتساب طبقة عدلات يحلل خلايا الدم الحمراء مجانا يعلق عدلات أولى فصل. اكتساب العدلات في طبقة IM.
اجمع خمسة ملليلتر من وسائط العزل في أنبوب الطرد المركزي. يسمح وضع وسائط العزل في الأنبوب بالعمل كمرشح ، حيث أن جهاز الطرد المركزي سيجبر الدم على النزول من خلاله بعناية. ضع طبقة خمسة ملليلتر من الدم فوق NIM لفصل نظيف.
كن حذرا جدا لتجنب خلط المحاليل. قم بتنفيذ هذه الخطوة ببطء وحذر ومع وجود طرف الماصة بالقرب من سطح وسائط التحليل لمنع خلط أجهزة الطرد المركزي. الحل في 500 RCF لمدة 35 دقيقة.
عند 20 إلى 25 درجة مئوية ، يجب أن ينفصل الدم إلى ستة نطاقات متميزة. النطاقات الستة هي الخلايا الوحيدة في البلازما ، ووسائط العزل ، والعدلات ، ووسائط العزل ، وحبيبات خلايا الدم الحمراء في الأسفل. إذا لم تكن هذه النطاقات الستة واضحة ومتميزة ، فإن عملية الفصل ليست نظيفة وستحتاج إلى تكرارها.
تشملالأسباب الشائعة للانفصال السيئ العزل القديم ، أو تناول المتبرع بوسائل الإعلام الكحول في ال 72 ساعة الماضية ، أو تناول المتبرع أدوية أخرى مثل تايلينول أو الأسبرين. قم بإزالة الخلايا الوحيدة في البلازما ووسائط العزل والتخلص منها بعناية. ضع هذه الطبقات في أنبوب قابل للغلق وتخلص بعناية من الماصة وطبقة العدلات وجميع وسائط العزل الموجودة أسفل العدلات في ملف طرد مركزي نظيف لاستعادة أكبر عدد ممكن من العدلات.
غالبا ما يكون من الأسهل تضمين بعض وسائط العزل من الطبقة أدناه أيضا. لا تزعج البليت في الأسفل. الإعلان الثاني ، صقل طبقة العدلات.
تمييع محلول العدلات إلى 10 ملليلتر مع HBSS بدون الكالسيوم. اقلب الأنبوب عدة مرات لتعليق أجهزة الطرد المركزي للخلايا. محلول العدلات.
350 RCF لمدة 10 دقائق. عند 20 إلى 25 درجة مئوية ، يجب أن تكون هناك حبيبات حمراء في قاع الأنبوب تحتوي على العدلات وخلايا الدم الحمراء المتبقية. قم بإزالة سوبرا ناتين باستخدام الماصة.
كن حذرا. لإزعاج الحبيبات في الأسفل. تحلل خلايا الدم الحمراء.
يجب الآن تدمير خلايا الدم الحمراء في العينة عن طريق التحلل. لتحلل خلايا الدم الحمراء المتبقية ، أضف ملليلترين من محلول تحلل الخلايا الحمراء إلى الأنبوب إلى إعادة الضغط. قم بتعليق دوامة الحبيبات على القارورة في إعداد من ثلاثة إلى أربعة.
تجنب زيادة إعداد الدوامة فوق أربعة لأن هذا قد يتسبب في تنشيط العدلات. قد يكون من الضروري الدوامة لعدة ثوان أو نبض الدوامة لإذابة الحنك. جهاز الطرد المركزي لمحلول التحلل عند 250 RCF لمدة خمس دقائق.
استخدم خيار البدء الناعم لتقليل الضرر الذي يلحق بالعينة. قم بإزالة supra natin مع الماصة. كرر عملية التحلل.
إذا لزم الأمر ، قم بتحرير تعليق العدلات ، أضف 500 ميكرولتر HBSS بدون كالسيوم إلى كل أنبوب. دوامة الحبيبات في إعداد من ثلاثة إلى أربعة ، تخفيفها إلى 10 ملليلتر باستخدام HPSS بدون جهاز طرد مركزي للكالسيوم. تستنشق العدلات عند 250 RCF لمدة خمس دقائق snat وتتخلص منها.
أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من HBSS بمحلول HSA ، مرتين في 10 إلى ستة. عادة ما يتم جمع العدلات لكل مليلتر.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لعزل العدلات البشرية من الدم الكامل باستخدام تقنية فصل التدرج الكثافة القياسي. تلعب العدلات دورًا حاسمًا في الاستجابة المناعية الالتهابية، وفهم عزلها حيوي للبحث الإضافي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
- علم الأعصاب
الخلفية
- العدلات هي من بين أول المستجيبين في الاستجابات الالتهابية.
- تمت دراسة وظائفها وآليات عملها بشكل مكثف في المختبر.
- تقنيات العزل ضرورية لدراسة سلوك العدلات ووظائفها.
- تحسن الطرق القياسية من قابلية البحث للتكرار.
هدف الدراسة
- لإثبات طريقة موثوقة لعزل العدلات من الدم البشري.
- لتسهل البحث الإضافي حول وظائف العدلات في الالتهاب.
- لتوفير بروتوكول يمكن اعتماده بسهولة في المختبرات.
الطرق المستخدمة
- طريقة فصل التدرج الكثافة.
- استخدام وسائط الفصل المتاحة تجاريًا.
- تشمل المعدات جهاز الطرد المركزي والقوارير.
- تحضير المحاليل باستخدام HBSS مع كلوريد الكالسيوم وألبومين المصل البشري.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للعدلات من عينات الدم الكامل.
- إثبات فعالية طريقة الفصل.
- توفير بروتوكول واضح للباحثين.
- تطبيقات محتملة في دراسة سلوك العدلات في ظروف مختلفة.
الاستنتاجات
- الطريقة المعروضة فعالة لعزل العدلات.
- يمكن لهذا البروتوكول تعزيز البحث حول الاستجابات المناعية.
- يمكن للدراسات الإضافية أن تبني على تقنية العزل هذه.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Reliable neutrophil isolation is foundational for early-stage immunology and inflammation research, enabling precise functional studies and mechanistic de-risking in drug discovery. High-purity, high-viability neutrophil preparations support robust target validation and quantitative assay development, directly impacting predictive confidence at key portfolio inflection points. Standardized isolation protocols facilitate reproducibility and cross-functional data integration across discovery and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neutrophil-specific pathways and immune mechanisms relevant to inflammation and oncology.
- Supports functional target validation by providing pure, viable neutrophil populations for downstream assays.
- Reduces biological ambiguity, strengthening predictive confidence in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability neutrophil samples for reproducible in vitro assays.
- Facilitates quantitative measurement of neutrophil functions such as phagocytosis and cytokine production.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular material for modeling inflammatory responses in preclinical systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell function and viability.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling functional readouts in human immune cells.
Pipeline & Workflow Integration
This density gradient neutrophil isolation protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supplies pure neutrophils for hypothesis-driven functional studies and pathway analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell-based assay inputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of cell viability, purity, and functional outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models using primary human immune cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across multiple research programs and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in immune cell studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of neutrophil-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of inflammation and immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in density gradient separation and cell handling.
- Needs access to centrifugation equipment, sterile reagents, and validated separation media.
- Demands strict adherence to timing and temperature controls to preserve cell viability.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible outputs across studies.
- Limited by donor variability and short neutrophil lifespan, requiring rapid downstream use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
