الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية
مايو 11, 2018
ونحن قد هندسة البروتين قفيصه من فيروس التهاب الكبد الوبائي ه نانوحبيبات ثيرانوستيك (هيفنب). هيفنب تجميع ذاتي في قفص icosahedral مستقرة في إيصال المخاطية. وهنا يصف لنا بتعديل هيفنبس للورم الاستهداف بتحور يتعرض سطح المخلفات إلى سيستينيس، الذي متزاوجة يغاندس الاصطناعية التي تربط الخلايا السرطانية على وجه التحديد.
الهدف العام من الوظيفية الكيميائية لسطح الجسيمات النانوية HEV هو توفير نهج قابل للتكرار ومتسق لاقتران الجزيئات المناعية والعلاجية والتشخيصية على سطح الجسيمات النانوية HEV لأغراض التشخيص والعلاج. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب النانوي مثل كيفية مراقبة الاستهداف المعزز للسرطان وتوزيع العلاجات النانوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكرار بدرجة كبيرة وفعالة وأسهل بكثير في التحقيق عند مقارنتها بتوليد الهندسة الوراثية.
سيوضح الإجراءات ميشيل نجوين وإيفان رويز ، مساعدا باحثين من مختبرنا. ابدأ هذا البروتوكول بإنتاج جسيمات النانو لفيروس التهاب الكبد E وتنقيتها كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتخفيف عينات الجسيمات النانوية من HEV إلى ما بين 0.5 وملليغرامين لكل مليلتر باستخدام 10 ملليمولار MES ، ودرجة الحموضة 6.2 لتصوير TEM.
قم بتأين الشبكات المطلية بالكربون بتفريغ توهج 40 مللي أمبير لمدة 30 ثانية لإنتاج سطح كربون محب للماء. يمكن أن يستمر سطح الكربون المحب للماء للشبكات لمدة 30 دقيقة فقط بعد معالجة تفريغ التوهج. بعد التأين ، أمسك الشبكة والملاقط وأضف ميكرولترين من عينة الجسيمات النانوية HEV إلى الشبكة.
بعد 15 إلى 30 ثانية ، قم بمسح الشبكة بورق الترشيح. ثم اغسل الشبكة على الفور بالماء المقطر المزدوج وامسح مرة أخرى بورق الترشيح. أضف على الفور ميكرولترين من أسيتات اليورانيل بنسبة اثنين بالمائة إلى الشبكة.
بعد 15 ثانية ، امسح الشبكة بورق الترشيح. جفف شبكات العينة عن طريق وضعها في خزانة جافة إلكترونية لمزيل الرطوبة طوال الليل. اعتمادا على العينة ، قد يكون الفحص المجهري الإلكتروني المبرد أو cryo-EM ضروريا لتصور الهيكل وتوصيفه.
انقل الشبكة إلى TEM والصورة بتكبير من 10 إلى 80 كلفن. تظهر الجسيمات النانوية HEV في TEM كبروتينات عشرية الوجوه فارغة يبلغ قطرها حوالي 27 نانومتر بسبب عدم وجود الحمض النووي الريبي الفيروسي. لإجراء الاقتران المكون من خطوة واحدة للجسيمات النانوية HEV والبيوتين المرتبط بالماليميد ، قم أولا بتطبيق الجسيمات النانوية HEV على وحدات غسيل الكلى المصغرة.
غسيل الكلى للجسيمات النانوية مقابل 0.01 مولار PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد غسيل الكلى ، انقل الجسيمات النانوية HEV إلى أنابيب سعة 1.5 مليلتر وقم بقياس تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. امزج الجسيمات النانوية بمقدار واحد ملليغرام لكل مليلتر بكمية متساوية من 100 ميكرومولار من البيوتين ماليميد و 0.01 مولار PBS pH 7.4 لتكوين نسبة واحد إلى خمسة مولار.
بعد التفاعل بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة بيوتين ماليميد غير المرتبط باستخدام إجراء عمود تحلية المياه وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تحليل العينات من خلال صفحة SDS القياسية المختزلة. باستخدام الإجراءات القياسية ، قم بإعداد لطخة غربية كيميائية باستخدام الستربتافيدين المرتبط ب HRP والتقاط إشارة التلميء الكيميائي بواسطة فيلم الأشعة السينية.
لإجراء اقتران من خطوتين للرابط الخاص بخلايا سرطان الثدي ، LXY30 ، على السيستين المكشوف للسطح على الجسيمات النانوية HEV ، قم أولا بتطبيق الجسيمات النانوية على وحدات غسيل الكلى المصغرة وغسيل الكلى مقابل 0.01 مولار PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم انقل الجسيمات النانوية HEV إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر وقم بقياس تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، امزج بين 650 ميكرومولار ماليميد أزيد و 650 ميكرومولار ألكين LXY30 مع 200 كبريتات النحاس ميكرومولار وحمض الأسكوربيك المليمولي.
هذا يشكل LXY 30 المرتبط بالماليميد عند 650 ميكرومولار. احتضن الخليط عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، امزج الجسيمات النانوية HEV مع ملليغرام واحد لكل مليلتر مع حوالي 10٪ من حجم LXY 30 المرتبط بالماليميد لتكوين نسبة من واحد إلى ثلاثة مولار.
تفاعل بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. نظرا للتركيز العالي نسبيا ل maleimide LXY 30 ، يتم تقليل التركيزات النهائية للمواد المتفاعلة مثل كبريتات النحاس حوالي 10 مرات بعد الخلط. لتجنب تلفها على الجسيمات النانوية لفيروس التهاب الكبد E ، هناك خيار آخر وهو طريقة المساهمة الخالية من النحاس.
قم بإزالة maleimide غير المرتبط انقر فوق LXY 30 مع عمود تحلية الدوران وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. احتفظ بجسيمات الهيدروجين النانوية المرتبطة ب LXY 30 عند أربع درجات مئوية. لإجراء اقتران من خطوة واحدة للجسيمات النانوية LXY 30 HEV وعلامة الفلورسنت Cy5.5 ، قم أولا بخلط الجسيمات النانوية المرتبطة ب LXY 30 إلى ملليغرام واحد لكل مليلتر بحجم متساو من علامة الفلورسنت Cy5.5 لتكوين نسبة من واحد إلى خمسة مولار.
بعد تفاعل الخليط بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة Cy5.5 NHS غير المرتبط بإجراء عمود تحلية الدوران وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. احتفظ بجسيمات HEV النانوية المرتبطة ب LXY 30 Cy5.5 عند أربع درجات مئوية. تمت تجربة طريقتين لتشغيل LXY 30 لجزيئات HEV النانوية لاستهداف الخلايا السرطانية.
عندما تم ربط الجسيمات النانوية HEV 573C ب maleimide azide أولا ، متبوعا بتفاعل كيمياء النقر على ألكين LXY 30 ، بدا أن الجسيمات النانوية HEV 573C تتفكك تحت مراقبة TEM. ومع ذلك ، فإن تفاعل كيمياء النقر الأولي بين ألكين LXY 30 وأزيد ماليميد لتشكيل LXY 30 المرتبط بالماليميد متبوعا بالاقتران لمساعدة الجسيمات النانوية المعدلة HEV لم يؤثر على هيكلها وظلت الجسيمات النانوية HEV 573C سليمة. تم تطبيق الجسيمات النانوية المرتبطة ب LXY 30 و Cy5.5 على خلايا سرطان الثدي المستنبتة وتمت ملاحظتها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
تشير صور التألق القريب من الأشعة تحت الحمراء بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر إلى أن الجسيمات النانوية HEV المرتبطة ب LXY 30 Cy5.5 لها تقارب ارتباط أعلى لزيادة الاستيعاب في خلايا سرطان الثدي MDA MB 231 مقارنة بجسيمات HEV النانوية المرتبطة ب Cy5.5. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فحص الاستهداف متعدد الوسائط والجزيئات العلاجية التي تسمح باستهداف الورم وتشخيصه بدقة دون التسبب في تلف الخلايا الطبيعية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاستهداف السرطان والأورام من خلال التعديل السطحي الكيميائي ، إلا أنه يمكن تطبيقها على التشخيص المبكر للسرطان والفحص والعلاج الموجه بالتصوير.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
المحة عامة
تقدم هذه الدراسة هندسة بروتين غلاف فيروس التهاب الكبد الوبائي E إلى جسيم نانو العلاجي (HEVNP) لعلاج الأورام المستهدف. تم تعديل HEVNPs لتعزيز استهداف الورم من خلال ترافُق الروابط الاصطناعية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الطب النانو
- العلاج المستهدف
- طب الأورام
الخلفية
- تتجمع HEVNPs ذاتيًا في هياكل مستقرة.
- يمكن أن يؤدي تعديل الجسيمات النانوية إلى تحسين قدرات الاستهداف.
- فهم توزيع العلاجات أمر بالغ الأهمية في علاج السرطان.
- هذا النهج أكثر كفاءة مقارنة بطرق الهندسة الوراثية التقليدية.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة متسقة لوظيفنة HEVNPs.
- تعزيز استهداف الخلايا السرطانية باستخدام روابط اصطناعية.
- تسهيل تشخيص وعلاج الأورام.
الطرق المستخدمة
- إنتاج وتنقية جسيمات HEV النانوية.
- تخفيف عينات HEVNP للتصوير.
- ترافُق الروابط إلى بقايا السيستئين المكشوفة على السطح.
- استخدام الميكروسكوب الإلكتروني النافذ (TEM) للتحليل.
النتائج الرئيسية
- يمكن تعديل HEVNPs بشكل فعال لاستهداف الورم.
- طريقة الترافُق قابلة للتكرار وفعالة.
- تم إثبات تعزيز استهداف الخلايا السرطانية.
- تم تسليط الضوء على التطبيقات المحتملة في التشخيصات والعلاجات.
الاستنتاجات
- تمثل HEVNPs منصة واعدة للعلاج من السرطان.
- تسمح التعديلات السطحية بالتوصيل المستهدف للعوامل العلاجية.
- يمكن أن يتقدم هذا الأسلوب مجال الطب النانو.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Chemical surface functionalization of virus-like particles enables modular and reproducible conjugation of targeting ligands and imaging agents without genetic modification, supporting rapid prototyping of theranostic nanocarriers. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing systematic screening of diverse biomolecules on a stable nanoparticle scaffold. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving consistent, scalable display of functional entities for downstream oncology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise display of tumor-targeting ligands like LXY30 on HEV nanoparticles.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for evaluating ligand-receptor interactions using cysteine-directed conjugation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid comparison of ligand affinity and internalization efficiency in cancer cell models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable nanoconjugates with defined ligand density for standardized binding and uptake assays.
- Operational Value: Enables batch-to-batch consistency in nanoparticle functionalization, critical for assay reproducibility.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for high-throughput screening of targeting moieties.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Produces tumor-targeted HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) validated in breast cancer cell models, supporting progression to preclinical studies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates that pre-forming maleimide-linked LXY30 via click chemistry preserves nanoparticle integrity, reducing structural failure risk.
- Disease-Relevant System: Uses MDA-MB-231 cells to assess internalization and binding affinity, aligning with therapeutic relevance in triple-negative breast cancer.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling preparation of functionalized nanocarriers for preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing modular conjugation of immunogenic, therapeutic, and diagnostic molecules to HEV nanoparticles.
- Screening: Delivers assay-ready nanoparticles with reproducible surface modification for quantitative evaluation of targeting efficiency.
- Analytics: Generates measurable outputs via TEM, Western blot, and confocal microscopy to compare conjugation success and cellular uptake.
- Translational Research: Links discovery to preclinical continuity through demonstration of tumor-specific binding and internalization in cultured cancer cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable conjugation platform applicable to other macromolecular complexes with known structures.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through precise, cysteine-specific ligand display without altering nanoparticle assembly.
- Operational Value: Offers high reproducibility and efficiency compared to genetic engineering, reducing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid screening of ligands and imaging tags on a stable nanocarrier.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement by generating theranostic candidates with validated tumor targeting and imaging capabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry, conjugation techniques, and nanoparticle purification.
- Depends on access to dialysis units, spectrophotometry, SDS-PAGE, Western blotting, and confocal microscopy.
- Necessitates standardization across teams for consistent protein concentration measurement and reaction conditions.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other nanoparticle systems with different surface-exposed residues.
- Includes practical limitations such as nanoparticle disassembly if conjugation order is not optimized, as seen with premature maleimide azide binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
HEVNP Characterization
2:46
Chemical Conjugation of HEVNPs with Biotin, Cancer Targeting Ligand, and Fluorophores
7:05
Results: Production of LXY30-HEVNPs and Binding/Internalization of Fluorescently Labeled LXY30-HEVNPs in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells
8:35
Conclusion
