الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية

الهدف العام من الوظيفية الكيميائية لسطح الجسيمات النانوية HEV هو توفير نهج قابل للتكرار ومتسق لاقتران الجزيئات المناعية والعلاجية والتشخيصية على سطح الجسيمات النانوية HEV لأغراض التشخيص والعلاج. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب النانوي مثل كيفية مراقبة الاستهداف المعزز للسرطان وتوزيع العلاجات النانوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكرار بدرجة كبيرة وفعالة وأسهل بكثير في التحقيق عند مقارنتها بتوليد الهندسة الوراثية.

سيوضح الإجراءات ميشيل نجوين وإيفان رويز ، مساعدا باحثين من مختبرنا. ابدأ هذا البروتوكول بإنتاج جسيمات النانو لفيروس التهاب الكبد E وتنقيتها كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتخفيف عينات الجسيمات النانوية من HEV إلى ما بين 0.5 وملليغرامين لكل مليلتر باستخدام 10 ملليمولار MES ، ودرجة الحموضة 6.2 لتصوير TEM.

قم بتأين الشبكات المطلية بالكربون بتفريغ توهج 40 مللي أمبير لمدة 30 ثانية لإنتاج سطح كربون محب للماء. يمكن أن يستمر سطح الكربون المحب للماء للشبكات لمدة 30 دقيقة فقط بعد معالجة تفريغ التوهج. بعد التأين ، أمسك الشبكة والملاقط وأضف ميكرولترين من عينة الجسيمات النانوية HEV إلى الشبكة.

بعد 15 إلى 30 ثانية ، قم بمسح الشبكة بورق الترشيح. ثم اغسل الشبكة على الفور بالماء المقطر المزدوج وامسح مرة أخرى بورق الترشيح. أضف على الفور ميكرولترين من أسيتات اليورانيل بنسبة اثنين بالمائة إلى الشبكة.

بعد 15 ثانية ، امسح الشبكة بورق الترشيح. جفف شبكات العينة عن طريق وضعها في خزانة جافة إلكترونية لمزيل الرطوبة طوال الليل. اعتمادا على العينة ، قد يكون الفحص المجهري الإلكتروني المبرد أو cryo-EM ضروريا لتصور الهيكل وتوصيفه.

انقل الشبكة إلى TEM والصورة بتكبير من 10 إلى 80 كلفن. تظهر الجسيمات النانوية HEV في TEM كبروتينات عشرية الوجوه فارغة يبلغ قطرها حوالي 27 نانومتر بسبب عدم وجود الحمض النووي الريبي الفيروسي. لإجراء الاقتران المكون من خطوة واحدة للجسيمات النانوية HEV والبيوتين المرتبط بالماليميد ، قم أولا بتطبيق الجسيمات النانوية HEV على وحدات غسيل الكلى المصغرة.

غسيل الكلى للجسيمات النانوية مقابل 0.01 مولار PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد غسيل الكلى ، انقل الجسيمات النانوية HEV إلى أنابيب سعة 1.5 مليلتر وقم بقياس تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. امزج الجسيمات النانوية بمقدار واحد ملليغرام لكل مليلتر بكمية متساوية من 100 ميكرومولار من البيوتين ماليميد و 0.01 مولار PBS pH 7.4 لتكوين نسبة واحد إلى خمسة مولار.

بعد التفاعل بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة بيوتين ماليميد غير المرتبط باستخدام إجراء عمود تحلية المياه وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تحليل العينات من خلال صفحة SDS القياسية المختزلة. باستخدام الإجراءات القياسية ، قم بإعداد لطخة غربية كيميائية باستخدام الستربتافيدين المرتبط ب HRP والتقاط إشارة التلميء الكيميائي بواسطة فيلم الأشعة السينية.

لإجراء اقتران من خطوتين للرابط الخاص بخلايا سرطان الثدي ، LXY30 ، على السيستين المكشوف للسطح على الجسيمات النانوية HEV ، قم أولا بتطبيق الجسيمات النانوية على وحدات غسيل الكلى المصغرة وغسيل الكلى مقابل 0.01 مولار PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم انقل الجسيمات النانوية HEV إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر وقم بقياس تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، امزج بين 650 ميكرومولار ماليميد أزيد و 650 ميكرومولار ألكين LXY30 مع 200 كبريتات النحاس ميكرومولار وحمض الأسكوربيك المليمولي.

هذا يشكل LXY 30 المرتبط بالماليميد عند 650 ميكرومولار. احتضن الخليط عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، امزج الجسيمات النانوية HEV مع ملليغرام واحد لكل مليلتر مع حوالي 10٪ من حجم LXY 30 المرتبط بالماليميد لتكوين نسبة من واحد إلى ثلاثة مولار.

تفاعل بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. نظرا للتركيز العالي نسبيا ل maleimide LXY 30 ، يتم تقليل التركيزات النهائية للمواد المتفاعلة مثل كبريتات النحاس حوالي 10 مرات بعد الخلط. لتجنب تلفها على الجسيمات النانوية لفيروس التهاب الكبد E ، هناك خيار آخر وهو طريقة المساهمة الخالية من النحاس.

قم بإزالة maleimide غير المرتبط انقر فوق LXY 30 مع عمود تحلية الدوران وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. احتفظ بجسيمات الهيدروجين النانوية المرتبطة ب LXY 30 عند أربع درجات مئوية. لإجراء اقتران من خطوة واحدة للجسيمات النانوية LXY 30 HEV وعلامة الفلورسنت Cy5.5 ، قم أولا بخلط الجسيمات النانوية المرتبطة ب LXY 30 إلى ملليغرام واحد لكل مليلتر بحجم متساو من علامة الفلورسنت Cy5.5 لتكوين نسبة من واحد إلى خمسة مولار.

بعد تفاعل الخليط بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة Cy5.5 NHS غير المرتبط بإجراء عمود تحلية الدوران وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. احتفظ بجسيمات HEV النانوية المرتبطة ب LXY 30 Cy5.5 عند أربع درجات مئوية. تمت تجربة طريقتين لتشغيل LXY 30 لجزيئات HEV النانوية لاستهداف الخلايا السرطانية.

عندما تم ربط الجسيمات النانوية HEV 573C ب maleimide azide أولا ، متبوعا بتفاعل كيمياء النقر على ألكين LXY 30 ، بدا أن الجسيمات النانوية HEV 573C تتفكك تحت مراقبة TEM. ومع ذلك ، فإن تفاعل كيمياء النقر الأولي بين ألكين LXY 30 وأزيد ماليميد لتشكيل LXY 30 المرتبط بالماليميد متبوعا بالاقتران لمساعدة الجسيمات النانوية المعدلة HEV لم يؤثر على هيكلها وظلت الجسيمات النانوية HEV 573C سليمة. تم تطبيق الجسيمات النانوية المرتبطة ب LXY 30 و Cy5.5 على خلايا سرطان الثدي المستنبتة وتمت ملاحظتها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.

تشير صور التألق القريب من الأشعة تحت الحمراء بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر إلى أن الجسيمات النانوية HEV المرتبطة ب LXY 30 Cy5.5 لها تقارب ارتباط أعلى لزيادة الاستيعاب في خلايا سرطان الثدي MDA MB 231 مقارنة بجسيمات HEV النانوية المرتبطة ب Cy5.5. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فحص الاستهداف متعدد الوسائط والجزيئات العلاجية التي تسمح باستهداف الورم وتشخيصه بدقة دون التسبب في تلف الخلايا الطبيعية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاستهداف السرطان والأورام من خلال التعديل السطحي الكيميائي ، إلا أنه يمكن تطبيقها على التشخيص المبكر للسرطان والفحص والعلاج الموجه بالتصوير.