كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي ، مثل ما هي الأهمية البيولوجية ل RdRP أو TERT في الخلايا البشرية؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن هذا الاختبار تم إنشاؤه كأول طريقة حساسة للكشف عن نشاط RdRP البشري المعبر عنه في الخلايا. ابدأ هذا الإجراء بإعداد خلايا HeLa كما هو موضح في بروتوكول النص.

اغسل الخلايا مرة واحدة ب 10 مل من PBS. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 1،450 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. استخدم ملليلتر واحد من محلول التحلل المثلج البارد A لكل 10 ملايين خلية لتحلل الخلايا عن طريق سحب العينة اللطيف.

صوتنة العينة في أنبوب 1.5 ملليلتر بتضخيم صوتنة بنسبة 25٪ لمدة 10 ثوان. بعد الصوتنة ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 20 ، 400 مرة من الجاذبية لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية ، وانقل ملليلترا واحدا لكل من المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر.

قم بتنظيف المحللة مسبقا عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من حبات البروتين A-agarose المغسولة مسبقا لكل مليلتر واحد من المحلل. تخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. ثم قم بتدوير العينة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

قم بالطرد المركزي للعينة عند 13 ، 000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية ، واسترجع المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من حبات البروتين A-agarose المغسولة مسبقا و 10 ميكروغرام من الجسم المضاد TERT المضاد للإنسان في المحللة التي تم تطهيرها مسبقا. تخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات ، وقم بتدوير العينة عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

بعد الطرد المركزي عند 3 ، 300 مرة من الجاذبية لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، اغسل الخرزات باستخدام Wash Buffer One. أضف ملليلترا واحدا من Wash Buffer One إلى الخرزات ، واخلطها جيدا عن طريق قلب الأنبوب.

بعد ذلك، قم بتدوير العينة لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. الطرد المركزي للعينة عند 3 ، 300 مرة الجاذبية لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات إضافية.

بعد غسل محلول AGC كما هو موضح في بروتوكول النص ، عالج الخرزات بنوكلاز المكورات الدقيقة عن طريق تعليقها في 60 ميكرولترا من خليط تفاعل نوكلياز المكورات الدقيقة عن طريق سحب العينة اللطيف. بعد ذلك ، رج العينة برفق على قرص دوار لشاكر موضوعة في حاضنة من نوع بلتيير لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي للعينة عند 3 ، 300 مرة من الجاذبية لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية.

أخيرا ، اغسل الخرزات مرتين بمحلول AGC يحتوي على ثلاثة مللي مولار EGTA ، واغسل الخرزات مرة واحدة باستخدام Wash Buffer Two كما هو موضح في بروتوكول النص. تحضير خليط تفاعل RdRP في أنبوب جديد كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف ستة ميكرولترات من يوريدين ثلاثي الفوسفات المسمى على مجموعة فوسفات ألفا مع P dash 32 إلى خليط التفاعل ، واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات.

ثم أضف ميكرولتر واحد من قالب الحمض النووي الريبي إلى الخليط واخلطه جيدا. أعد تعليق الخرزات ب 20 ميكرولتر من خليط تفاعل RdRP الناتج. بعد ذلك ، رج العينة برفق على قرص دوار لشاكر موضوعة في حاضنة من نوع بلتيير لمدة ساعتين عند 32 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، أضف 5.4 ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل مليلتر من البروتيناز K و 45.4 ميكرولتر من 2X Proteinase K Buffer إلى خليط التفاعل. تخلط عن طريق سحب العينة ، ورج العينة في حاضنة من نوع بلتيير لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد إضافة 109.2 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى العينة ، أضف 200 ميكرولتر من حمض الفينول الكلوروفورم.

تخلط جيدا عن طريق الدوامة قبل الطرد المركزي للعينة عند 21 ، 100 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.

ثم أضف 20 ميكرولترا من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية ، ودرجة الحموضة 5.2 ، وأربعة ميكرولترات من حامل الترسيب ، و 250 ميكرولتر من الإيثانول إلى المرحلة المائية. رج الأنبوب جيدا للخلط. قم بالطرد المركزي للعينة عند 21 ، 100 مرة من الجاذبية لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.

بعد ذلك ، اغسل الحبيبات ب 300 ميكرولتر من الإيثانول البارد 70٪ الحجم لكل حجم مخزن عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. الطرد المركزي للعينة عند 21 ، 100 مرة الجاذبية لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وجفف الحبيبات في الهواء.

أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. تحضير خليط تفاعل RNase في أنبوب جديد كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف 180 ميكرولتر من خليط تفاعل RNase إلى العينة.

ثم احتضان الأنبوب لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. أضف 2.3 ميكرولتر من حجم 10٪ لكل حجم SDS إلى العينة ، واحتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من 20 ملليغرام لكل مليلتر من البروتيناز K إلى العينة ، واحتضانه لمدة 15 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية.

الآن ، أضف 205 ميكرولتر من حمض الفينول كلوروفورم إلى العينة. بعد الخلط والطرد المركزي كما كان من قبل ، انقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. أضف ثلاثة أسيتات الصوديوم المولارية, حامل الترسيب, والإيثانول إلى المرحلة المائية, متبوعا بالخلط, الطرد المركزي, وغسل الحبيبات كما تم إجراؤها سابقا.

تظهر هنا ثلاث نتائج تمثيلية لمقايسة IP-RdRP في خلايا HeLa المعالجة بالنوكودازول أو DMSO للخلايا غير المتلاعب بها. تم استخدام الحمض النووي الريبي المكون من 34 نيوكليوتيد المركب كيميائيا كقالب. بعد التعرض بين عشية وضحاها ، يمكن رؤية منتجات RdRP بين 20 إلى 30 نيوكليوتيد ، وتحديدا في خلايا HeLa ضمن المرحلة الانقسامية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف نشاط RdRP ل TERT البشري.