الأسلوب كفاءة ريفولدينج وتنقية ليجند تشيموريسيبتور ملزمة المجال

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة إعادة مجال ربط الترابط للمستقبلات الكيميائية من أجسام التضمين وتنقيته لاستخدامه في الدراسات الهيكلية والوظيفية. لتحديد الإشارات التي يرسلها المستقبل الكيميائي البكتيري وكيف ، يمكن للمرء استخدام مجالات ربط الترابط المعزولة للفحص ضد مكتبات الجزيئات الصغيرة أو لتحديد الهيكل مع الترابط وبدونه. غالبا ما يؤدي كمع مجال ربط الترابط خارج الخلية في الإشريكية القولونية إلى الترسب في أجسام التضمين.

هنا ، نوضح كيف يمكن استرداد كمية ملليغرام من البروتين الوظيفي من الأجسام المشمولة. للبدء ، قم بتلقيح 150 مل من مرق LB المعقم الذي يحتوي على 50 ميكروغرام لكل مل من الأمبيسلين مع خلايا BL21-CodonPlus RIPL التي تم تحويلها باستخدام ناقل pET151 D-TOPO للتعبير عن هيكسهيستيدين TIp3-LBD. احتضان الثقافة عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

قم بإعداد ست قوارير إرلينماير سعة 2 لتر تحتوي على 800 مل من مرق LB المعقم و 50 ميكروغرام لكل مل من الأمبيسلين. تلقيح كل قارورة ب 20 مل من المزرعة الليلية. احتضان القوارير عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر عند 200 دورة في الدقيقة حتى يصل OD600 إلى 0.6.

في هذه المرحلة ، قم بتحفيز التعبير عن البروتين عن طريق إضافة 1 مللي مولار IPTG إلى كل قارورة. استمر في احتضان القوارير عند 37 درجة مئوية في شاكر بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات إضافية. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5000 xg وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

ثم تخلص من الطافف. انقل جميع كريات الخلية إلى دورق سعة 250 مل وأضف 100 مل من Buffer A.إذا تم تجميدها ، اترك الخلايا تذوب تماما ثم أعد تعليق الحبيبات. احتفظ بالعينة على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك.

بعد ذلك ، قم بتمرير الخلايا المعلقة من خلال الخالط عالي الضغط ثلاث مرات لتحلل الخلايا وضمان القص الكامل للحمض النووي الجيني. ثم ، قم بالطرد المركزي للمحللات عند 10 ، 000 xg وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. اجمع عينة مل واحدة من المادة الطافية وقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لتحليل SDS-PAGE اللاحق.

ثم تخلص من باقي المادة الطافية وضع الحبيبات على الثلج. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق حبيبات الأجسام الشاملة في 20 مل من العازلة المثلجة الباردة B.This يسهل إذابة بروتينات الغشاء والغشاء. دوامة العينة لمدة دقيقة إلى دقيقتين للمساعدة في إعادة التعليق.

بعد الطرد المركزي للعينة ، قم بإعادة تعليق الحبيبات جيدا مرة أخرى في 20 مل من Buffer B البارد عن طريق إرسال الأنبوب أولا لمدة دقيقة إلى دقيقتين. تأكد من تقسيم الحبيبات إلى قطع صغيرة. بعد ذلك، قم بسحب العينة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليقها.

الطرد المركزي العينة كما كان من قبل وتخلص من المادة الطافية. إذا كان المادة الطافية غائمة أو ملونة ، فقم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى واستخدم Buffer B البارد المثلج الإضافي لإعادة تعليقها. كرر الطرد المركزي وإعادة التعليق حتى يصبح المادة الطافية صافية وعديمة اللون قبل التكوير مرة أخرى.

أضف 20 مل من Buffer C المثلج البارد إلى الحبيبات وأعد تعليقها عن طريق دوامة الأنبوب لمدة دقيقة إلى دقيقتين. ثم, بعد تدوير العينة, أضف 25 مل من تغيير طبيعة الجليد البارد Buffer D.قم بتعليق حبيبات أجسام التضمين تماما عن طريق دوامة الأنبوب لمدة دقيقة إلى دقيقتين أو حتى يتم تقسيم الحبيبات إلى قطع صغيرة. امزج التعليق عن طريق الدوران المحوري عند 30 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة 30 إلى 120 دقيقة.

قم بتوضيح محلول البروتين المشوه عن طريق الطرد المركزي عند 30،000 xg وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم ضع المادة الطافية على الثلج وتخلص من الحبيبات. أثناء تقليب 250 مل من Buffer E عند 500 دورة في الدقيقة ، أضف 60 ملليغرام من مزيج البروتين المشوه الذي يحتوي على سداسي هيستادين TIp3-LBD.

احتضن مزيج إعادة الطي عند أربع درجات مئوية مع التحريك المستمر عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 24 إلى 48 ساعة. تركيز البروتين النهائي هو 0.2 مجم لكل مل. بعد تحضير سبعة لترات من العازلة A المبردة مسبقا وأنابيب غسيل الكلى وفقا لبروتوكول النص ، استخدم إغلاق أنبوب غسيل الكلى لتثبيت أحد طرفي غشاء غسيل الكلى ونقل خليط غسيل الكلى إلى الأنبوب.

ثم قم بتثبيت الطرف المفتوح وتأكد من عدم وجود تسريبات. ضع أنبوب غسيل الكلى في دلو غسيل الكلى باستخدام المخزن المؤقت المبرد مسبقا أ.ثم أضف قضيب تحريك مغناطيسي ، مع التأكد من أنه لن يلمس أنبوب غسيل الكلى أثناء التحريك. غسيل الكبري للعينة عند أربع درجات مئوية مع التحريك المستمر عند 500 دورة في الدقيقة وتغيير المخزن المؤقت أربع مرات على الأقل خلال فترة 12 ساعة.

بعد آخر تغيير في المخزن المؤقت ، اترك العينة لغسيل الكلى طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة أنبوب غسيل الكلى من الدلو وانقل محتوياته إلى دورق سعة 500 مل. احتفظ بمحلول البروتين على الثلج ما لم يذكر خلاف ذلك.

قم بتصفية محلول البروتين من خلال غشاء بحجم مسام 0.43 ميكرون في زجاجة زجاجية سعة 500 مل لإزالة أي بروتين مترسب. بعد غسل عمود مخلب وشحنه وموازنه وفقا لبروتوكول النص ، اضبط عينة البروتين المعاد طيها التي تم الحصول عليها وفقا لتكوين Buffer F عن طريق إضافة 25 مل من 5 M كلوريد الصوديوم ، و 2.5 مل من 1 M tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 2.5 مل من محاليل مخزون 2 M Imidazole. قم بتحميل العينة على العمود بمعدل 5 مل في الدقيقة أو أقل وتخلص من التدفق الذي يحتوي على البروتينات غير المرتبطة.

بعد ذلك ، اغسل العمود ب 50 إلى 100 مل من Buffer F لإزالة البروتينات غير المرتبطة على وجه التحديد والتخلص من التدفق. قم بتقطيع السداسي هيستادين TIp3-LBD ب 25 مل من Buffer G. ثم قم بتجميع كسور التدفق التي تحتوي على البروتين. بعد تحضير Buffer H وأنابيب غسيل الكلى وفقا لبروتوكول النص ، أضف سداسي الهيستادين الموسوم بالبروتياز TEV إلى البروتين المسمى بالهكساهيستادين في الأنبوب.

أضف نسبة مولية نهائية من TEV واحد إلى ثمانية من البروتين. ضع أنبوب غسيل الكلى المثبت في أربعة لتر من Buffer H المبرد مسبقا واحتضنه عند أربع درجات مئوية مع التحريك المستمر لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بتغيير المخزن المؤقت واستمر في غسيل الكلى طوال الليل للسماح باكتمال تفاعل الانقسام بوساطة TEV.

بعد التبادل إلى Buffer I ، وتصفية محلول البروتين وضبط العينة مرة أخرى ، قم بتحميل العينة على عمود HP مخلب HiTrap سعة خمسة مل مجهز. بمعدل تدفق يبلغ خمسة مل في الدقيقة ، اجمع التدفق الذي يحتوي على TIp3-LBD غير المميز. على البروتين المشقوق ، يتم الاحتفاظ بعلامة السداسي الهيستادين المشقوقة والسداسي هيستادين TEV بواسطة العمود.

استخدم خمسة مل من Buffer F لغسل العمود للسماح للبروتين غير الموسوم بالتدفق من خلاله وجمع الشطف. بعد ذلك ، بعد موازنة عمود استبعاد الحجم وتركيز عينة البروتين وتوضيحها وفقا لبروتوكول النص ، قم بتحميل العينة على عمود ترشيح الهلام المتوازن مسبقا 26/60. ضع Buffer A بمعدل تدفق أربعة مل في الدقيقة وراقب تتبع الأشعة فوق البنفسجية لشطف البروتين.

يميل TIp3-LBD بحجم احتفاظ من 210 إلى 220 مل. أخيرا ، بعد الكروماتوغرافيا ، قم بتجميع الكسور ثم قم بقياس تركيز البروتين وتنفيذ SDS-PAGE. أسفر إجراء عزل البروتين الموضح في هذا الفيديو عن 10 إلى 20 مجم من TIp3-LBD النقي غير الموسوم لكل لتر واحد من الثقافة البكتيرية.

كما هو موضح هنا ، فإن البروتين المخرج من عمود ترشيح الهلام له ذروة واحدة متناظرة ، تتوافق مع حجم احتفاظ يبلغ 220 مل مع وزن جزيئي محسوب يبلغ 29 كيلو دالتون. كما هو موضح هنا بواسطة SDS-PAGE ، تحتوي الأجسام الشاملة في الغالب على هيكساهيستادين TIp3-LBD بوزن جزيئي واضح يبلغ 28 كيلو دالتون ، وهو قريب من القيمة المحسوبة من تسلسل الأحماض الأمينية البالغة 31.8 كيلو دالتون. أسفرت خطوات إزالة علامة الهكساهيستادين ، وكروماتوغرافيا التقارب ، وترشيح الهلام عن بروتين عالي النقاء.

كشف التحليل الطيفي للقرص المضغوط باستخدام CDSSTR أن الهيكل الثانوي لسيكس هيستيدين TIp3-LBD يتكون من 31٪ ألفا حلزون و 23٪ من محتوى ورقة بيتا. كانت هذه أيضا قريبة من القيم المتوقعة البالغة 37٪ و 26٪ على التوالي من تحليل التسلسل باستخدام خادم JPred 3. يتطلب هذا البروتوكول ما لا يقل عن خمسة أيام من البداية إلى النهاية ، ويمكن إيقافه مؤقتا إذا لزم الأمر في ثلاث مراحل مختلفة.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن إعادة التعليق الشامل والكامل لأجسام التضمين في المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة عن طريق الدوامة أو سحب العينة لأعلى ولأسفل أمر بالغ الأهمية لهذا الإدراك بأكمله. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة تنقية مجال ربط الترابط للمستقبلات الكيميائية TIp3. يمكن استخدام البروتين المنقى لربط الأحماض للتحقيق في خصوصية الترابط لهذا المستقبل.

بالإضافة إلى ذلك ، أظهرنا سابقا أن البروتين الذي تم الحصول عليه من خلال هذا الإجراء يمكن استخدامه لإنتاج بلورات عالية الترتيب ، وهذا مهد الطريق لدراسات الأساس الهيكلي لخصوصية الترابط. قد يكون هذا الإجراء مفيدا بشكل عام لإنتاج كميات ملغية من المستقبلات الكيميائية من البكتيريا الأخرى في شكل قابل للتبلور وقابل للذوبان. لقد استخدمنا هذا البروتوكول في شكله الأصلي أو المعدل قليلا لإعادة تنقية مجال ربط الترابط للمستقبلات الكيميائية الأخرى من هذا النوع للدراسات البلوراتية.

يرجى تذكر أنه في كل حالة منفصلة ، من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى تحسين البروتوكول ، على سبيل المثال ، من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى تكوين المخازن المؤقتة لتغيير طبيعة وإعادة طي وأوقات الحضانة.