تطوير مثبطات البروتين البروتين التفاعلات استبدال من خلال: تطبيق لتصميم وتطوير غير ATP مثبطات معلمين تنافسي

الهدف العام من الاستراتيجية هو توليد جزيء صغير فعال يشبه الدواء من خلال تحويل مثبط الببتيد لتفاعل البروتين البروتيني. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء علاقة نشاط هيكلي لتفاعل بروتين الببتيد المطلوب لفهم الأجزاء التي يمكن استبدالها بشكل فعال كخطوة ثانية. تستخدم الكيمياء الحسابية لتحديد بدائل الشظايا القابلة للتطبيق لمحددات الببتيد المعروفة ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتجميع مكتبة من الهجينة الببتيد الشظايا.

بعد ذلك ، يتم تصنيع مكتبة من الهجينة بين هذه الأجزاء والببتيد المقطوع من أجل توليد جزيئات يمكن اختبارها في اختبار في المختبر لتحديد الجزيئات الأكثر شبها بالأدوية والتي تلخص نشاط الببتيد الأصلي. تظهر النتائج أنه يمكن تحديد المزيد من المركبات الشبيهة بالأدوية باستخدام المنهجية ، وتمثل هذه نقاط انطلاق فعالة لاكتشاف الأدوية لمثبطات تفاعلات البروتين البروتيني. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص عالي الإنتاجية هي أن جر بروتين البروتين يمثل تحديا كبيرا من منظور اكتشاف الأدوية ، والطرق التقليدية لا تعمل بشكل جيد.

تتضمن استراتيجية الاستبدال النهج التكراري التدريجي وبالتالي قد تستغرق وقتا أطول أو من المرجح أن تكون فعالة على المدى الطويل. سأعرض اليوم معظم الإجراءات مع بعض المساعدة من زميلتي ، الدكتورة ساندرا كريج ، التي ستقوم بإعداد بعض ردود الفعل والإجراءات. ابدأ هذا الإجراء بالتحقق من صحة بروتوكول الإرساء ، متبوعا بإعداد موقع ربط المستقبلات والروابط كما هو موضح في بروتوكول النص لربط الروابط في أخدود Cyclin.

أولا ، حدد روتين ملاءمة الترابط من بروتوكول تفاعلات ترابط المستقبل المعين للبرنامج ، واستخدم المستقبل والروابط المحضرة كمدخلات لهذا البروتوكول. بالنسبة لهذه عمليات التشغيل ، حدد PLP واحد كشبكة طاقة. شبكة الطاقة التي يستخدمها برنامج الإرساء هي مجال القوة لتوليد تفاعلات مستقبلات الترابط والأوضاع المحتملة.

Plp الأول هو إمكانات خطية حكيمة للسلام ، والتي تعطي الأولوية على وجه التحديد لتفاعلات الترابط الهيدروجيني. حدد أن يتم تقليل الطاقة إلى الحد الأدنى وعدد الوضعيات المتولدة على أنه 10. اترك جميع المعلمات الأخرى في القيم الافتراضية في المقام الأول.

اعرض الأوضاع في برنامج المتخيل ثم قم بالفرز حسب القيم التنازلية لدرجة PLP الواحدة. استخدم وظائف التسجيل مثل plp ، واحدة لتقدير تقارب الارتباط للترابط الراسي بناء على وضعية الترابط المرشح والهندسة والتفاعل غير التساهمي مع بنية المستقبل المستهدف. قم بتحليل أعلى 25٪ من الأوضاع المسجلة بصريا للاستحالة الفائقة مع مجموعة السد المعروفة.

لاحظ أيضا ما إذا كانت الوضعية قد حققت مرشحات تفاعل ، والتي تم تعيينها لتشمل قيود الذرة التي تتطلب اتصالات بين الجزيئات معروفة بأنها حاسمة للارتباط و / أو مطلوبة لوضع مجموعة السد المحتملة في الهندسة الصحيحة لتكوين رابطة الأميد. أخيرا ، افحص الأوضاع من أجل التكامل البصري ، والذي يعرف بأنه ملء فعال لجيب الربط بطريقة تتوافق مع نشاط الهيكل المعروف. علاقات تخليق مجموعات السد النهائي ، واستخدام جميع مواد البداية التجارية والمذيبات والكواشف وتوليفها بواسطة الكيمياء العضوية الاصطناعية التقليدية.

قم بإجراء كروماتوغرافيا طبقة رقيقة أو TLC على هلام السيليكا لمراقبة التفاعلات عن طريق إذابة مادة البداية وخليط التفاعل أولا في المرحلة المحمولة. ثم حدد مادة البداية الذائبة وخليط التفاعل على لوحة TLC باستخدام أنابيب شعرية. ضع لوحة TLC في الغرفة التي تحتوي على المرحلة المتحركة.

بمجرد أن تصل المرحلة المتنقلة إلى 90٪ من لوحة TLC ، قم بإزالة اللوحة وجففها بالهواء. استخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن المواد الأولية ومخاليط التفاعل كبقع مرئية. ثم احسب التردد اللاسلكي لكل بقعة ، وهي نسبة المسافة التي تقطعها البقعة والمرحلة المتنقلة.

بعد ذلك ، ضع خليط التفاعل في قمع منفصل واغسله بحمض مائي أو محلول أساسي حسب الاقتضاء. اجمع المذيب العضوي وتبخره في مبخر دوار قبل التجفيف. المنتج الخام الذي تم الحصول عليه تحت فراغ يذوب 500 ملليغرام من المنتج الخام في ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من المذيبات المناسبة ويضاف إلى السيليكا أو RP 18 عينة منه قبل التجفيف تحت الهواء ، ووضع عينة تحتوي على المنتج الخام في السيليكا ، خراطيش المفاجئة العكسية.

تنقية المواد الخام باستخدام كروماتوغرافيا فلاش آلية عالية الأداء. استخدام عمود 100 جرام مع تدرج. قم بتشغيل أكثر من 15 وحدة تخزين عمود.

جفف المنتج المنقى الذي تم جمعه في مذيب من كروماتوغرافيا الفلاش باستخدام مبخر دوار عن طريق تبخير كل المذيب حتى يجف. ثم قم بتجفيف المنتج تحت الفراغ لإزالة جميع المذيبات المتبقية. قم بإجراء توصيف للمنتج المنقى بواسطة NMR MS و HPLC التحليلي كما هو موضح في بروتوكول النص لتجميع جزء نهاية الغطاء أو الببتيدات المثبطة المربوطة أو تجميع التقلبات.

المركبات الهضمية المنتهية من خلال طرق تخليق الطور الصلب القياسية. قم بتنشيط خمسة مكافئات من الحمض الأميني الطرفي C في 4.4 مكافئ من HBTU في ملليلترين من ثنائي ميثيل فورماميد أو DMF لمدة خمس دقائق. قم بتحميل الخليط على راتنج حلبة التزلج باستخدام ستة مكافئات من أمين ثنائي الأيزوبروبيل إيثيل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة مجموعة حماية FM من بقايا الطرف C باستخدام 20٪ INE في ثلاثة ملليلتر من DMF لمدة 10 دقائق. زوجان من الأحماض الأمينية اللاحقة خطوة بخطوة في كل خطوة. زوجان خمسة مكافئات من الحمض الأميني التالي باستخدام ستة مكافئات من DI isopropyl ، وإيثيل أمين ، و 4.4 ما يعادل HBTU في ملليلترين من DMF لمدة ساعة واحدة.

في درجة حرارة الغرفة ، قم بتطبيق دورات الغسيل بعد اقتران الأحماض الأمينية وخطوات الحماية FM D بعد تجميع الببتيد. مجموعات السد الزوجية N باستخدام ستة مكافئات من DI isopropyl ، وإيثيل أمين ، و 4.4 مكافئ من HBTU في ملليلترين من DMF لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة عند الانتهاء من تجميع الببتيد. عالج خليط التفاعل بملليلترين من خليط الانقسام طوال الليل لإزالة مجموعات حماية السلسلة الجانبية ، وتقلبات Cleve من الراتنج ، وقم بتقشير المنتج الناتج باستخدام الأثير داثيل البارد لترسيب وإذا لزم الأمر ، ركز في مبخر دوار ، قم بتصفية المادة الصلبة الناتجة وجفافها تحت الفراغ أو تجميدها باستخدام مجفف التجميد.

في هذه المرحلة ، انتقل إلى مقايسة ربط الاستقطاب الفلوري كما هو موضح في بروتوكول النص لتحديد الربط التنافسي. يظهر الهيكل النموذجي ل H-A-K-R-R-L-I-F المرتبط بأخدود ربط الإعصار. يتكون أخدود ركوب الدراجات من جيبين كارهين للماء ، وجيب أساسي أكبر وجيب ثانوي أصغر ، يتم سدها بواسطة بقايا حمضية مصورة باللون الأحمر.

تشمل التفاعلات المهمة الأخرى اتصالات الترابط الهيدروجيني للعمود الفقري للببتيد وتفاعلات الاقتران الأيوني للمخلفات الأساسية الثلاثة للببتيد هنا ، يتم عرض وضع الربط لثلاثة خمسة D-C-P-T-R-L-I-F ، يتم عرضه مع تفاعلات الترابط الهيدرجيني مع ذرات السلسلة الجانبية من التربتوفان اثنين 17 والجلوتامين 2 54 الراسية. يتم عرض أوضاع من ثلاث مجموعات تمثيلية وسد مع كل من هذه المركبات التي تمتلك روابط هيدروجينية مع ذرات مرشح التفاعل للتربتوفان اثنين 17 والجلوتامين 2 54. كما هو موضح في الخطوط الخضراء المتقطعة ، فإن الشمر القائم يجعل تفاعلات جدار فاندر مع الجيب الثانوي الكارهة للماء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم أفضل لكيفية أداء وتطبيق استراتيجية الاستبدال ، وتحويل مثبط الببتيد المعروف إلى جزيء أكثر شبها بالأدوية ، والذي يمنع جر البروتين ، وهو نقطة انطلاق للتطوير العلاجي.