تطوير مثبطات البروتين البروتين التفاعلات استبدال من خلال: تطبيق لتصميم وتطوير غير ATP مثبطات معلمين تنافسي
October 26th, 2015
نصف تنفيذ استراتيجية REPLACE لاستهداف تفاعلات البروتين والبروتين. REPLACE هي استراتيجية تكرارية تتضمن مناهج تركيبية وحسابية لتحويل مثبطات الببتيد المحسنة إلى جزيئات شبيهة بالأدوية.
الهدف العام من الاستراتيجية هو توليد جزيء صغير فعال يشبه الدواء من خلال تحويل مثبط الببتيد لتفاعل البروتين البروتيني. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء علاقة نشاط هيكلي لتفاعل بروتين الببتيد المطلوب لفهم الأجزاء التي يمكن استبدالها بشكل فعال كخطوة ثانية. تستخدم الكيمياء الحسابية لتحديد بدائل الشظايا القابلة للتطبيق لمحددات الببتيد المعروفة ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتجميع مكتبة من الهجينة الببتيد الشظايا.
بعد ذلك ، يتم تصنيع مكتبة من الهجينة بين هذه الأجزاء والببتيد المقطوع من أجل توليد جزيئات يمكن اختبارها في اختبار في المختبر لتحديد الجزيئات الأكثر شبها بالأدوية والتي تلخص نشاط الببتيد الأصلي. تظهر النتائج أنه يمكن تحديد المزيد من المركبات الشبيهة بالأدوية باستخدام المنهجية ، وتمثل هذه نقاط انطلاق فعالة لاكتشاف الأدوية لمثبطات تفاعلات البروتين البروتيني. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص عالي الإنتاجية هي أن جر بروتين البروتين يمثل تحديا كبيرا من منظور اكتشاف الأدوية ، والطرق التقليدية لا تعمل بشكل جيد.
تتضمن استراتيجية الاستبدال النهج التكراري التدريجي وبالتالي قد تستغرق وقتا أطول أو من المرجح أن تكون فعالة على المدى الطويل. سأعرض اليوم معظم الإجراءات مع بعض المساعدة من زميلتي ، الدكتورة ساندرا كريج ، التي ستقوم بإعداد بعض ردود الفعل والإجراءات. ابدأ هذا الإجراء بالتحقق من صحة بروتوكول الإرساء ، متبوعا بإعداد موقع ربط المستقبلات والروابط كما هو موضح في بروتوكول النص لربط الروابط في أخدود Cyclin.
أولا ، حدد روتين ملاءمة الترابط من بروتوكول تفاعلات ترابط المستقبل المعين للبرنامج ، واستخدم المستقبل والروابط المحضرة كمدخلات لهذا البروتوكول. بالنسبة لهذه عمليات التشغيل ، حدد PLP واحد كشبكة طاقة. شبكة الطاقة التي يستخدمها برنامج الإرساء هي مجال القوة لتوليد تفاعلات مستقبلات الترابط والأوضاع المحتملة.
Plp الأول هو إمكانات خطية حكيمة للسلام ، والتي تعطي الأولوية على وجه التحديد لتفاعلات الترابط الهيدروجيني. حدد أن يتم تقليل الطاقة إلى الحد الأدنى وعدد الوضعيات المتولدة على أنه 10. اترك جميع المعلمات الأخرى في القيم الافتراضية في المقام الأول.
اعرض الأوضاع في برنامج المتخيل ثم قم بالفرز حسب القيم التنازلية لدرجة PLP الواحدة. استخدم وظائف التسجيل مثل plp ، واحدة لتقدير تقارب الارتباط للترابط الراسي بناء على وضعية الترابط المرشح والهندسة والتفاعل غير التساهمي مع بنية المستقبل المستهدف. قم بتحليل أعلى 25٪ من الأوضاع المسجلة بصريا للاستحالة الفائقة مع مجموعة السد المعروفة.
لاحظ أيضا ما إذا كانت الوضعية قد حققت مرشحات تفاعل ، والتي تم تعيينها لتشمل قيود الذرة التي تتطلب اتصالات بين الجزيئات معروفة بأنها حاسمة للارتباط و / أو مطلوبة لوضع مجموعة السد المحتملة في الهندسة الصحيحة لتكوين رابطة الأميد. أخيرا ، افحص الأوضاع من أجل التكامل البصري ، والذي يعرف بأنه ملء فعال لجيب الربط بطريقة تتوافق مع نشاط الهيكل المعروف. علاقات تخليق مجموعات السد النهائي ، واستخدام جميع مواد البداية التجارية والمذيبات والكواشف وتوليفها بواسطة الكيمياء العضوية الاصطناعية التقليدية.
قم بإجراء كروماتوغرافيا طبقة رقيقة أو TLC على هلام السيليكا لمراقبة التفاعلات عن طريق إذابة مادة البداية وخليط التفاعل أولا في المرحلة المحمولة. ثم حدد مادة البداية الذائبة وخليط التفاعل على لوحة TLC باستخدام أنابيب شعرية. ضع لوحة TLC في الغرفة التي تحتوي على المرحلة المتحركة.
بمجرد أن تصل المرحلة المتنقلة إلى 90٪ من لوحة TLC ، قم بإزالة اللوحة وجففها بالهواء. استخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن المواد الأولية ومخاليط التفاعل كبقع مرئية. ثم احسب التردد اللاسلكي لكل بقعة ، وهي نسبة المسافة التي تقطعها البقعة والمرحلة المتنقلة.
بعد ذلك ، ضع خليط التفاعل في قمع منفصل واغسله بحمض مائي أو محلول أساسي حسب الاقتضاء. اجمع المذيب العضوي وتبخره في مبخر دوار قبل التجفيف. المنتج الخام الذي تم الحصول عليه تحت فراغ يذوب 500 ملليغرام من المنتج الخام في ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من المذيبات المناسبة ويضاف إلى السيليكا أو RP 18 عينة منه قبل التجفيف تحت الهواء ، ووضع عينة تحتوي على المنتج الخام في السيليكا ، خراطيش المفاجئة العكسية.
تنقية المواد الخام باستخدام كروماتوغرافيا فلاش آلية عالية الأداء. استخدام عمود 100 جرام مع تدرج. قم بتشغيل أكثر من 15 وحدة تخزين عمود.
جفف المنتج المنقى الذي تم جمعه في مذيب من كروماتوغرافيا الفلاش باستخدام مبخر دوار عن طريق تبخير كل المذيب حتى يجف. ثم قم بتجفيف المنتج تحت الفراغ لإزالة جميع المذيبات المتبقية. قم بإجراء توصيف للمنتج المنقى بواسطة NMR MS و HPLC التحليلي كما هو موضح في بروتوكول النص لتجميع جزء نهاية الغطاء أو الببتيدات المثبطة المربوطة أو تجميع التقلبات.
المركبات الهضمية المنتهية من خلال طرق تخليق الطور الصلب القياسية. قم بتنشيط خمسة مكافئات من الحمض الأميني الطرفي C في 4.4 مكافئ من HBTU في ملليلترين من ثنائي ميثيل فورماميد أو DMF لمدة خمس دقائق. قم بتحميل الخليط على راتنج حلبة التزلج باستخدام ستة مكافئات من أمين ثنائي الأيزوبروبيل إيثيل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة مجموعة حماية FM من بقايا الطرف C باستخدام 20٪ INE في ثلاثة ملليلتر من DMF لمدة 10 دقائق. زوجان من الأحماض الأمينية اللاحقة خطوة بخطوة في كل خطوة. زوجان خمسة مكافئات من الحمض الأميني التالي باستخدام ستة مكافئات من DI isopropyl ، وإيثيل أمين ، و 4.4 ما يعادل HBTU في ملليلترين من DMF لمدة ساعة واحدة.
في درجة حرارة الغرفة ، قم بتطبيق دورات الغسيل بعد اقتران الأحماض الأمينية وخطوات الحماية FM D بعد تجميع الببتيد. مجموعات السد الزوجية N باستخدام ستة مكافئات من DI isopropyl ، وإيثيل أمين ، و 4.4 مكافئ من HBTU في ملليلترين من DMF لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة عند الانتهاء من تجميع الببتيد. عالج خليط التفاعل بملليلترين من خليط الانقسام طوال الليل لإزالة مجموعات حماية السلسلة الجانبية ، وتقلبات Cleve من الراتنج ، وقم بتقشير المنتج الناتج باستخدام الأثير داثيل البارد لترسيب وإذا لزم الأمر ، ركز في مبخر دوار ، قم بتصفية المادة الصلبة الناتجة وجفافها تحت الفراغ أو تجميدها باستخدام مجفف التجميد.
في هذه المرحلة ، انتقل إلى مقايسة ربط الاستقطاب الفلوري كما هو موضح في بروتوكول النص لتحديد الربط التنافسي. يظهر الهيكل النموذجي ل H-A-K-R-R-L-I-F المرتبط بأخدود ربط الإعصار. يتكون أخدود ركوب الدراجات من جيبين كارهين للماء ، وجيب أساسي أكبر وجيب ثانوي أصغر ، يتم سدها بواسطة بقايا حمضية مصورة باللون الأحمر.
تشمل التفاعلات المهمة الأخرى اتصالات الترابط الهيدروجيني للعمود الفقري للببتيد وتفاعلات الاقتران الأيوني للمخلفات الأساسية الثلاثة للببتيد هنا ، يتم عرض وضع الربط لثلاثة خمسة D-C-P-T-R-L-I-F ، يتم عرضه مع تفاعلات الترابط الهيدرجيني مع ذرات السلسلة الجانبية من التربتوفان اثنين 17 والجلوتامين 2 54 الراسية. يتم عرض أوضاع من ثلاث مجموعات تمثيلية وسد مع كل من هذه المركبات التي تمتلك روابط هيدروجينية مع ذرات مرشح التفاعل للتربتوفان اثنين 17 والجلوتامين 2 54. كما هو موضح في الخطوط الخضراء المتقطعة ، فإن الشمر القائم يجعل تفاعلات جدار فاندر مع الجيب الثانوي الكارهة للماء.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم أفضل لكيفية أداء وتطبيق استراتيجية الاستبدال ، وتحويل مثبط الببتيد المعروف إلى جزيء أكثر شبها بالأدوية ، والذي يمنع جر البروتين ، وهو نقطة انطلاق للتطوير العلاجي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة إستراتيجية REPLACE لاستهداف تفاعلات البروتين-البروتين، والتي تهدف إلى تحويل مثبطات الببتيد إلى جزيئات شبيهة بالأدوية. تجمع المنهجية بين الأساليب التركيبية والحسابية لتعزيز اكتشاف الأدوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- اكتشاف الأدوية
- تفاعلات البروتين-البروتين
- الكيمياء الحسابية
الخلفية
- تفاعلات البروتين-البروتين هي أهداف صعبة لاكتشاف الأدوية.
- غالبًا ما تفشل الطرق التقليدية مثل الفحص عالي الإنتاجية في هذا المجال.
- يمكن أن تكون مثبطات الببتيد بمثابة نقاط انطلاق لتطوير علاجات الجزيئات الصغيرة.
- تهدف إستراتيجية REPLACE إلى تحسين الخصائص الشبيهة بالأدوية لهذه المثبطات.
هدف الدراسة
- لإنشاء أدوية فعالة من الجزيئات الصغيرة من مثبطات الببتيد.
- لتأسيس علاقات بين البنية والنشاط لتفاعلات الببتيد-البروتين.
- لتحديد بدائل شظايا قابلة للتطبيق للمحددات الببتيدية المعروفة.
الطرق المستخدمة
- تأسيس علاقات بين البنية والنشاط.
- الكيمياء الحسابية لتحديد الشظايا.
- تركيب مكتبة من الهجينات الببتيدية الشظوية.
- اختبارات مخبرية لفحص الخصائص الشبيهة بالأدوية للجزيئات المُنتَجَة.
النتائج الرئيسية
- تم تحديد المزيد من المركبات الشبيهة بالأدوية باستخدام منهجية REPLACE.
- تمثل هذه المركبات نقاط انطلاق فعالة لاكتشاف الأدوية.
- يتغلب الأسلوب على قيود أساليب الفحص عالي الإنتاجية التقليدية.
الاستنتاجات
- تعزز إستراتيجية REPLACE من الإمكانات لتطوير مثبطات لتفاعلات البروتين-البروتين.
- توفر هذه الطريقة أسلوبًا منهجيًا لاكتشاف الأدوية.
- يمكن للبحوث المستقبلية أن تبني على هذه النتائج لتحسين الخيارات العلاجية بشكل أكبر.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
The REPLACE strategy addresses a critical bottleneck in oncology drug discovery by enabling the conversion of peptide-based protein-protein interaction inhibitors into drug-like small molecules. This approach expands the targetable space for cyclin-dependent kinases (CDKs), which are frequently deregulated in cancer and represent high-value therapeutic targets. By improving the drug-like properties of peptide inhibitors targeting the cyclin binding groove, the method supports early-stage target validation and lead identification efforts in oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by validating the cyclin binding groove as a druggable site for selective CDK inhibition.
- Operational Value: Provides a systematic workflow for structure-activity relationship mapping to identify key residues amenable to replacement with fragment-like moieties.
- Predictive Value: Generates starting compounds with improved drug-likeness that recapitulate peptide inhibitor activity, supporting preclinical de-risking of CDK2/cyclin A interactions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces fragment peptide hybrid libraries suitable for in vitro fluorescence polarization binding assays to quantify competitive binding at the cyclin binding groove.
- Operational Value: Establishes a reproducible synthesis and purification protocol using standard organic chemistry techniques, enabling scalable generation of analogs.
- Assay Readiness: Delivers compounds with defined binding poses and interaction filters that can be used to establish robust, quantitative screening assays for downstream hit-to-lead campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports progression from biochemical inhibition to cellular context by yielding compounds that inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes, linking target engagement to phenotypic outcomes.
- Preclinical Alignment: Focuses on non-ATP competitive inhibition, offering a mechanistic avenue to avoid kinase domain selectivity challenges associated with ATP-competitive CDK inhibitors.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of binding mode conservation and interaction fingerprints, reducing uncertainty in target engagement prior to cellular efficacy testing.
Pipeline & Workflow Integration
The REPLACE strategy fits within the early discovery continuum, bridging peptide-based target validation and small molecule lead generation for oncology targets like CDKs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven validation of protein-protein interfaces by converting peptide inhibitors into synthetically tractable, drug-like molecules.
- Screening: Enables assay-ready compound libraries with measurable binding affinity and defined structure-activity relationships for hit identification.
- Analytics: Relies on docking scores, interaction filters, and visual complementarity assessments to prioritize compounds with favorable binding geometry and non-covalent interactions.
- Translational Research: Connects biochemical binding data to functional inhibition of CDK/cyclin complexes, supporting alignment with cell-based readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, iterative framework applicable to other protein-protein interactions beyond CDKs, promoting platform-like utilization across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by enabling structure-guided optimization of protein-protein interaction inhibitors with defined binding modes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized computational docking, fragment library synthesis, and purification protocols.
- Strategic Value: Increases predictive confidence in early-stage projects by reducing reliance on empirical screening for challenging targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of CDK inhibitors by providing early chemical matter with validated target engagement and improved drug-like properties.
Implementation Considerations
- Requires expertise in computational chemistry for docking protocol validation and pose analysis using energy minimization and scoring functions.
- Depends on access to standard synthetic organic chemistry infrastructure for peptide assembly, fragment ligation, and purification via flash chromatography.
- Necessitates cross-team alignment between modeling, synthesis, and assay teams to ensure consistency in fragment selection and hybrid library design.
- Involves adaptation considerations when applying the strategy to different protein-protein interfaces, particularly in defining interaction filters and capping group geometries.
- Practical limitations include the iterative nature of the approach, which may require multiple cycles of design, synthesis, and testing to achieve optimal drug-like properties.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
Computational Identification of Potential Small Molecule Capping Groups
4:03
Synthesis of Potential N-capping Groups
6:25
Solid Phase Synthesis for the Generation of FLIPs
8:45
Results: Identification of More Drug-like Inhibitors of CDK2 through the Cyclin Groove
9:59
Conclusion
