Name: نمذجة الروابط في الخرائط المشتقة من المجهر الإلكتروني بالتبريد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: اكتشف نمذجة الروابط الصغيرة في خرائط المجهر الإلكتروني بالتبريد باستخدام تقنية الجسيمات المنفردة. تُحسّن هذه الطريقة فهم تراكيب البروتينات الغشائية وتسريع اكتشاف الأدوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

حصلت SJ على منحة الدكتوراه من DAE-TIFR ، وتم الاعتراف بالتمويل. تقر KRV بمنحة DBT B-Life DBT / PR12422 / MED/31/287/2014 ودعم وزارة الطاقة الذرية ، حكومة الهند ، بموجب تحديد المشروع رقم. RTI4006.

نمذجة روابط الجزيئات الصغيرة في خرائط CryoEM للجزيئات الكبيرة

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

أدت التحسينات في أجهزة وبرامج المجهر إلى زيادة عدد هياكل cryoEM في السنوات الأخيرة. على الرغم من أن أعلى دقة تم تحقيقها في الوقت الحالي في cryoEM أحادي الجسيم هي 1.2 Å57،58،59 ، يتم تحديد غالبية الهياكل حول دقة 3-4 Å. يمكن أن تكون نمذجة الروابط في الخرائط متوسطة إلى منخفضة الدقة صعبة وغالبا ما تكون محفوفة بالغموض. نظرا للاستخدام الواسع النطاق ل cryoEM في كل من الأوساط الأكاديمية وصناعة الأدوية للبحث الانتقالي واكتشاف الأدوية ، فإن ضمان نمذجة الروابط بشكل صحيح وبدون غموض أمر ضروري. وبالتالي ، من الحكمة تحديد قابلية حل ذرات الليجند عن طريق حساب Q-scores60 ، والذي يتوفر الآن في EMDB كمقياس لتقييم جودة الخرائط وملاءمة النموذج وكذلك في Chimera.
في المثال الأول ، تم استخدام ChimeraX لحساب خريطة الفرق في الفضاء الحقيقي بين apo والخرائط المرتبطة بالليجند في إنزيم M. tuberculosis enolase. تشير الكثافة الإضافية عند عتبة عالية إلى وجود الربيطة ، فسفوينول بيروفات ، في الموقع النشط ، و Mg2+ مرتبطة بالليجند. من المهم ملاحظة أنه في هذه الحالة ، تكون الخريطة متوسطة الدقة (3.2 Å) ، ولا يمكن نمذجة جزيئات الماء بثقة (الشكل 1). القيد المرتبط بهذه الطريقة هو أنه لا يمكن تطبيقها إلا عندما لا يؤدي ربط الرباط إلى تغييرات توافقية كبيرة في البروتين. لم يتم إجراء تسوية الخريطة في هذه الحالة حيث تم الحصول على كل من مجموعات البيانات apo و ligand المرتبطة بنفس حجم البكسل ومعالجتها بمعلمات متطابقة في Relion. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه عند مقارنة الخرائط التي تم إنشاؤها بواسطة برامج إعادة الإعمار المختلفة ، مثل Relion46,47 و CryoSparc61 ، أو بجودة مختلفة ، يصبح تطبيع الخرائط ضروريا قبل إجراء مقارنات ذات مغزى.
المثال التالي هو mGlu5 ، الذي يخضع لإعادة تنظيم جزيئية كبيرة عند ارتباط ناهض ، كما يتضح من هياكل cryoEM51,62 (الشكل 2). في هذا السيناريو ، ليس من الممكن حساب خريطة فرق بسيطة بين المستقبلات غير المنضمة (apo) والمستقبلات المرتبطة بالرباط بسبب الاختلافات الجوهرية بين الخرائط. هنا ، تم استخدام Servalcat ، الذي يستخدم خرائط نصفية غير واضحة وغير موزونة كمدخلات للتحسين في الفضاء المتبادل ثم يحسب خريطة الفرق بين الخريطة التجريبية والخريطة المشتقة من النموذج. عند عتبة عالية ، يمكن للمرء أن يتصور الاختلافات ويعمل كدليل لتصحيح النموذج وتحسينه. لوحظت العديد من النقط غير النموذجية في المجال خارج الخلية وبالقرب من المجال عبر الغشاء ل mGlu5 واستخدمت كدليل لنمذجة الروابط (الشكل 2).
يوضح المثال الثالث كيف تلعب الدقة (2.3 Å) دورا حاسما في تفسير الخريطة ونمذجة مثبط بحجم الشظية في β-galactosidase. هنا ، كان التحدي هو تحديد ليجند صغير جدا (<200 دا) في خريطة فرق Servalcat وسط الضوضاء المتأصلة في البيانات ونمذجتها بدقة. بالإضافة إلى الدقة العالمية العالية المحددة باستخدام ارتباط صدفة فورييه (FSC) ، كانت الدقة المحلية الخاصة بالليجند عالية أيضا بما يكفي لضمان وضع دقيق للمراكز الشريانية للروابط (الشكل 3). لوحظت كثافة جزيئات المذيب في خريطة الفرق في جميع أنحاء الإنزيم وخاصة المحيطة بالليجند. كما تم توضيح تأثير الدقة على نمذجة الروابط وذرات المذيبات (الشكل 4). من المهم توخي الحذر عند نمذجة جزيئات الماء أو المذيبات لأنه في بعض الأحيان ، قد تشبه الضوضاء عند عتبة منخفضة جزيئات الماء أو المذيبات ، مما يؤدي إلى تفسيرات خاطئة محتملة.
هناك اعتبار مهم آخر وهو أن خرائط cryoEM وحدها قد لا تكون كافية لتحديد أيون معدني بدقة من تلقاء نفسها. غالبا ما تكون الطرق الفيزيائية الحيوية الإضافية مثل البنية الدقيقة لامتصاص الأشعة السينية الممتدة (EXAFS) أو التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX) ضرورية لتأكيد وجود وهوية أيون المعدن. في كل من إنزيمات enolase و β-galactosidase ، تم تصميم Mg2+ بسبب ثروة المعلومات المتاحة بالفعل عن هذه البروتينات ، مما يؤكد هوية أيون المعدن. أيضا ، قدم تنسيق أيونات المعادن في هذه الحالات ، والذي يتجسد في الهندسة ثماني السطوح الكلاسيكية ومسافات التنسيق شبه المثالية ل Mg2+ ، دليلا جوهريا على هويتها.
بشكل عام ، يجب مراعاة بعض الاعتبارات المهمة أثناء نمذجة الروابط في خرائط cryoEM. بادئ ذي بدء ، من المهم اختيار الخريطة الصحيحة لتحديد الليجند والنمذجة. في جميع الحالات ، ينصح باستخدام خريطة غير واضحة وغير موزونة أو نصف خريطة على خريطة حادة وموزونة لتصور كثافة الرباط ، حيث قد يؤدي الشحذ والترجيح إلى مناطق أقل حدة أو مفرطة في الوضوح (الضوضاء بسبب إنهاء السلسلة) في الخريطة. قد يؤدي ذلك إلى كثافة ليجند دون المستوى الأمثل ، ويمكن استخدام شحذ عامل B مختلف لتقييم الكثافة أثناء بناء النموذج في Coot. على الرغم من وجود خطر في استخدام الخريطة الحادة لتحديد الروابط في خريطة cryoEM ، إلا أن الخريطة غير الحادة قد لا تظهر التفاصيل الكاملة لكثافة الربيطة ولكن يمكن استخدامها لأغراض العرض التوضيحي ، كما هو موضح في الشكل 1B ، C.
يجب التحقق من صحة وضع الرباط النموذجي ، خاصة في الحالات التي تكون فيها البيانات ضعيفة. كما هو موضح هنا ل mGlu5 ، تختلف الدقة المحلية عبر خريطة cryoEM ، ويمكن أن تكون النمذجة غير المتحيزة لليجند صعبة. يمكن استخدام Servalcat كأداة قيمة للكشف عن عدم الدقة المحتملة في نمذجة البروتين والليجند22.
يمكن أن يكون عدم التجانس التركيبي موجودا في مجمع بروتين ليجند حيث قد يكون لدى مجموعة معينة فقط الرباط (إذا كان الربيطة ذات وزن جزيئي منخفض ، فقد لا تزيل خطوة التصنيف عدم التجانس). ومع ذلك ، من المهم إجراء تصنيف3D 63 خطوة بشكل متكرر أثناء معالجة الصور قبل نمذجة ligand والتحقق مما إذا كانت كثافة ligand تتحسن. في حالة وجود نسخ متعددة من البروتين ، يجب توخي الحذر عند تطبيق التماثل عبر الخريطة أثناء توليد النموذج الأولي وصقله ، لأن هذا قد يؤدي إلى متوسط كثافة الرباط في جميع الجزيئات المرتبطة بالتماثل. يجب فرض التماثل فقط بعد فحص الخريطة بدقة للتأكد من وجود كثافة الربيطة في جميع سلاسل البروتين.
اعتمادا على الحالة (بلورة أو محلول) والموقع (مدفون أو سطح) ، يمكن أن تكون الذرات ديناميكية ، وفي تحسين النموذج ، يشار إلى هذا باسم معلمة الإزاحة الذرية (ADP). جنبا إلى جنب مع خريطة الفرق ، التي توفر أدلة مرئية على عدم الدقة المحتملة في النموذج ، يمكن استخدام قيم ADP لتقييم دقة الروابط بعد الصقل64،65،66،67. عادة ، يجب أن يكون لليجند قيم ADP مماثلة للمخلفات المحيطة ، أي إذا كانت مرتبطة بثبات ونمذجة بدقة. ومع ذلك، فإن الروابط الموجودة في محيط أو ذرات الربيطة (مثل الليبيدات) البعيدة عن الجزيئات الكبيرة يمكن أن يكون لها قيم ADP أعلى. بالإضافة إلى تحسين الإحداثيات ، يسمح كل من Refmac33,34 و Phenix بتحسين قيم ADP28,68. في Refmac ، يتم استخدام تقريب Mott-Bethe لحساب عامل تشتت الإلكترون للذرات الفردية أثناء حساب الخريطة. في الإصدار الأخير من فينيكس ، تم إدخال صقل عامل B الفردي ، على غرار علم البلورات ، لحساب اضطراب الذرة. في كثير من الأحيان ، في النماذج المكررة المشتقة من cryoEM ، يتم ملاحظة مجموعة واسعة من قيم ADP (أحيانا تكون القيم قريبة من الصفر) ، وحتى درجة Q المستخدمة في EMDB لتقييم ملاءمة النموذج مع الخريطة تعتمد على الخريطة الأولية المودعة وطبيعة شحذ عامل B60. في بناء نموذج cryoEM ، غالبا ما يتم استخدام خرائط متعددة ، وبالتالي ، يجب ذكر الخرائط المستخدمة في النمذجة والتحسين بوضوح في الطرق ، نظرا لدقة تباين الخواص في العديد من الجزيئات الكبيرة ، قد لا تكون خريطة واحدة كافية لشرح جميع التفاصيل. 
في نمذجة الروابط في الجزيئات الكبيرة ، فإن أحد القيود الرئيسية لخرائط cryoEM (كما هو الحال في علم البلورات) هو أنه إذا كان موقع ربط الليجند منخفض الدقة أو إذا كان الربيطة المرتبطة ديناميكيا ، فقد يكون من الصعب التأكد من التشكل الصحيح. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معظم هياكل cryoEM لها دقة أقل من 3 Å ، وتمثيل جزيئات الماء في الخرائط محدود ، مما يجعل من الصعب تقييم دور الترطيب في ربط الليجند أو الدواء (كما هو موضح هنا مع أمثلة enolase و mGluR). يمكن استخدام الطرق الحسابية مع بيانات cryoEM لمعالجة هذه القيود69. على عكس علم البلورات ، يخضع النموذج فقط للتحسين ، وليس الخريطة. في الوقت الحاضر ، الطريقة الوحيدة للإشارة إلى وجود ليجند أو ضمان النمذجة الدقيقة هي عن طريق إنشاء خرائط محذوفة (باستخدام أدوات مثل Servalcat). وبالتالي ، هناك عدد من الأدوات لمساعدة الباحثين على بناء النموذج وتقييمه ، ولكن هناك العديد من المجالات في تحسين النموذج حيث يمكن توقع مناهج أو تعديلات أحدث للنهج الحالية في المستقبل القريب.
في هذه المقالة ، ركزنا على الأساليب الحالية لنمذجة الروابط ، والتي تشمل الفحص اليدوي لكثافة الليجند ، وإنشاء ملف هندسة الليجند ، متبوعا بنمذجة الربيطة في خريطة cryoEM. هذه فترة مثيرة في البيولوجيا الهيكلية واكتشاف الأدوية ، حيث أدت أجهزة الكشف عن الإلكترونات المباشرة ذات معدلات الإطارات الأسرع واستخدام الحصول على البيانات بشكل أسرع70 إلى الحصول على خرائط عالية الدقة (<2.8 Å) للعديد من الجزيئات الكبيرة التي غالبا ما ترتبط بروابط جزيئية صغيرة في وقت قصير نسبيا. إن الإدخال الأخير لأدوات نمذجة الرباط الآلية مثل GEMspot69 في جناح Schrodinger و EMERALD17 في مجموعة Rosetta ، والذي يحاول العثور على الوضع الأكثر احتمالا للربط مع مراعاة بيانات cryoEM التجريبية ، يبشر بتبسيط هذه العملية وأتمتتها. على غرار علم البلورات بالأشعة السينية ، من المتصور أن تحديد أنماط الارتباط للروابط الجزيئية الصغيرة بواسطة cryoEM ، ربما اثنين أو أكثر في يوم واحد ، سيصبح احتمالا واقعيا.

تنجز الخلايا وظائفها من خلال إجراء تفاعلات كيميائية لا حصر لها في وقت واحد وبشكل مستقل ، كل منها منظم بدقة لضمان بقائها وقدرتها على التكيف استجابة للإشارات البيئية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعرف الجزيئي ، والذي يمكن الجزيئات الحيوية ، وخاصة البروتينات ، من تكوين مجمعات عابرة أو مستقرة مع جزيئات كبيرة أخرى وكذلك جزيئات صغيرة أو روابط1. وبالتالي ، فإن تفاعلات البروتين والليجند أساسية لجميع العمليات في علم الأحياء ، والتي تشمل تنظيم تعبير البروتين ونشاطه ، والتعرف على الركائز والعوامل المساعدة بواسطة الإنزيمات ، وكذلك كيفية إدراك الخلايا لإشارات 1,2 وترحيلها. يكشف الفهم الأفضل للخصائص الحركية والديناميكية الحرارية والهيكلية لمركب البروتين والليجند عن الأساس الجزيئي لتفاعل الليجند ويسهل أيضا التصميم العقلاني للدواء من خلال تحسين التفاعل الدوائي والنوعية. يتمثل النهج الاقتصادي والأسرع لدراسة تفاعل البروتين والليجند في استخدام الالتحام الجزيئي ، وهي طريقة حسابية تفحص فعليا مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة وتتنبأ بوضع الارتباط وتقارب هذه الروابط لاستهدافالبروتينات 3. ومع ذلك ، فإن الأدلة التجريبية من الهياكل عالية الدقة التي يحددها حيود الأشعة السينية (XRD) أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) توفر الدليل الأساسي لمثل هذه التنبؤات وتساعد في تطوير منشطات أو مثبطات أحدث وأكثر فعالية لهدف معين. تستخدم هذه المقالة الاختصار "cryoEM" كما يشار إلى التقنية عادة. ومع ذلك ، هناك نقاش مستمر حول اختيار التسمية الصحيحة ، ومؤخرا ، تم اقتراح مصطلحcryo genic-sample Electron Microscopy (cryoEM) للإشارة إلى أن العينة في درجة حرارة مبردة ويتم تصويرها بالإلكترونات4. وبالمثل ، فإن الخرائط المشتقة من cryoEM تسمى جهد الإلكترون أو الجهد الكهروستاتيكي أو جهد كولوم ، وللتبسيط ، نستخدم هنا خرائط cryoEM5،6،7،8،9،10.
على الرغم من أن XRD كانت التقنية القياسية الذهبية في تحديد البنية عالية الدقة لمجمعات البروتين ، إلا أن cryoEM بعد ثورةالدقة 11 اكتسبت زخما ، كما يتضح من زيادة خرائط Coulomb المحتملة أو خرائط cryoEM المودعة في قاعدة بيانات المجهر الإلكتروني (EMDB) 12,13 على مدى السنوات القليلةالماضية 14. نظرا للتقدم في إعداد العينات والتصوير وطرق معالجة البيانات ، زاد عدد ترسبات بنك بيانات البروتين (PDB) 14 التي تستخدم cryoEM من 0.7٪ إلى 17٪ بين عامي 2010 و 2020 ، مع تحديد ما يقرب من 50٪ من الهياكل المبلغ عنها في عام 2020 بدقة 3.5 Å أو أفضل15,16. تم اعتماد CryoEM بسرعة من قبل مجتمع البيولوجيا الهيكلية ، بما في ذلك صناعة الأدوية ، لأنه يسمح بدراسة الجزيئات البيولوجية الكبيرة المرنة وغير البلورية ، وخاصة البروتينات الغشائية والمجمعات متعددة البروتينات ، بدقة شبه ذرية ، والتغلب على عملية التبلور والحصول على بلورات حيود جيدة المطلوبة لتحديد بنية عالية الدقة بواسطة XRD.
تعد النمذجة الدقيقة لليجند في خريطة cryoEM أمرا بالغ الأهمية ، لأنها بمثابة مخطط لمجمع البروتين والليجند على المستوى الجزيئي. هناك العديد من أدوات بناء الرباط الآلية المستخدمة في علم البلورات بالأشعة السينية والتي تعتمد على شكل وطوبولوجيا كثافة الربيطة من أجل ملاءمة أو بناء الربيطة في كثافة الإلكترون17،18،19،20. ومع ذلك ، إذا كانت الدقة أقل من 3 Å ، فإن هذه الأساليب تميل إلى إنتاج نتائج أقل استحسانا لأن السمات الطوبولوجية التي تعتمد عليها للاعتراف والبناء تصبح أقل تحديدا. في كثير من الحالات ، أثبتت هذه الطرق عدم فعاليتها في نمذجة الروابط بدقة في خرائط cryoEM ، حيث تم تحديد هذه الخرائط في نطاق الدقة المنخفضة إلى المتوسطة ، عادة بين 3.5 Å-5 Å17.
تتضمن الخطوة الأولى في تحديد بنية 3D لمركب البروتين والليجند بواسطة cryoEM إما التنقية المشتركة لليجند مع البروتين (عندما يكون لليجند تقارب ارتباط عالي بالبروتين) أو احتضان محلول البروتين مع الربيطة لمدة محددة قبل إعداد الشبكة. بعد ذلك ، يتم وضع حجم عينة صغير على شبكة TEM هولي تنظيفها بالبلازما ، يليها تجميد فلاش في الإيثان السائل والتصوير في النهاية باستخدام cryo-TEM. يتم حساب متوسط صور الإسقاط 2D من مئات الآلاف إلى الملايين من الجسيمات الفردية لإعادة بناء خريطة إمكانات كولوم ثلاثية الأبعاد (3D) للجزيء الكبير. يشكل تحديد ونمذجة الروابط وجزيئات المذيبات في هذه الخرائط تحديات كبيرة في كثير من الحالات بسبب دقة الخواص عبر الخريطة (أي أن الدقة ليست موحدة عبر الجزيء الكبير) ، والمرونة في المنطقة التي يرتبط فيها الربيطة ، والضوضاء في البيانات. يتم الآن تكييف العديد من أدوات النمذجة والتحسين والتصور التي تم تطويرها ل XRD للاستخدام في cryoEM لنفس الأغراض18،19،20،21. في هذه المقالة ، يتم تقديم نظرة عامة على الأساليب والبرامج المختلفة المستخدمة حاليا لتحديد الروابط وبناء النماذج وتحسين الإحداثيات المشتقة من cryoEM. تم توفير بروتوكول خطوة بخطوة لتوضيح العمليات التي تنطوي عليها نمذجة الروابط باستخدام معقدات بروتين ليجند محددة بدقة وتعقيد متفاوتين.
تتضمن الخطوة الأولى في نمذجة الروابط في خرائط cryoEM تحديد كثافة الربيطة (غير البروتينية) في الخريطة. إذا كان ارتباط الربيطة لا يحدث أي تغيير مطابق في البروتين ، فإن حساب خريطة فرق بسيطة بين مركب البروتين والليجند وبروتين apo يسلط الضوء بشكل أساسي على مناطق الكثافة الإضافية ، مما يشير إلى وجود الرباط. يمكن ملاحظة هذه الاختلافات على الفور ، لأنها تتطلب خريطتين فقط ، وحتى الخرائط الوسيطة أثناء عملية تحسين 3D يمكن استخدامها للتحقق مما إذا كان الرباط موجودا. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت الدقة عالية بما يكفي (<3.0 Å) ، فيمكن أن توفر خريطة الفرق أيضا نظرة ثاقبة لموقع جزيئات الماء وكذلك الأيونات التي تتفاعل مع الرباط وبقايا البروتين.
في غياب خريطة apo-protein ، أصبح من الممكن الآن استخدام Servalcat22 ، والذي يتوفر كأداة قائمة بذاتها وتم دمجه أيضا في مجموعة برامج CCP-EM23,24 كجزء من تحسين Refmac وفي إصدار CCP4 8.025,26. يسمح Servalcat بحساب خريطة الفرق المرجح FSC (Fo-Fc) باستخدام الخرائط النصفية غير الحادة ونموذج apoprotein كمدخلات. تمثل خريطة حذف Fo-Fc التباين بين الخريطة التجريبية (Fo) والخريطة المشتقة من النموذج (Fc). في حالة عدم وجود ليجند في النموذج ، فإن الكثافة الموجبة في خريطة Fo-Fc التي تتداخل مع خريطة EM التجريبية تشير عادة إلى وجود الرباط. الافتراض هنا هو أن سلسلة البروتين مثبتة جيدا في الخريطة ، وتشير الكثافة الموجبة المتبقية إلى موقع الرباط. ومع ذلك ، من المهم أن نفحص بدقة ما إذا كانت الكثافة الإيجابية تنبع من عدم دقة النمذجة ، مثل الدوار الخاطئ لسلسلة جانبية للبروتين.
تتضمن الخطوة الثانية الحصول على أو إنشاء ملف إحداثي ديكارتي لليجند بهندسة محددة جيدا من المعلومات الكيميائية المتاحة. يمكن استخدام الروابط القياسية (على سبيل المثال ، ATP و NADP +) المتوفرة بالفعل في مكتبة مونومر CCP4 للتحسين عن طريق استرداد ملفات الإحداثيات والهندسة عبر رمز انضمام المونومر الخاص بها. ومع ذلك ، بالنسبة للروابط غير المعروفة أو غير القياسية ، تتوفر أدوات مختلفة لإنشاء ملفات الهندسة. تتضمن بعض الأمثلة eLBOW27 - (منشئ الرباط الإلكتروني ومنضدة عمل التحسين) في Phenix28 ، Lidia - أداة مدمجة في Coot29 ، JLigand / ACEDRG30,31 ، CCP-EM23,24 ، Ligprep32-وحدة من Glide داخل مجموعة Schrodinger. ثم يتم تركيب ملف إحداثيات الرباط في الكثافة ، مسترشدا بكل من خريطة cryoEM التجريبية وخريطة الفرق في Coot. ويتبع ذلك تحسين الفضاء الحقيقي في فينيكس28 أو التحسين المتبادل في Refmac33. مطلوب محطة عمل Linux أو كمبيوتر محمول مزود ببطاقة رسومات جيدة والبرامج المذكورة أعلاه. يتم تضمين معظم هذه البرامج في أجنحة مختلفة. CCP-EM24 و Phenix28 متاحان مجانا للمستخدمين الأكاديميين ويتضمنان مجموعة متنوعة من الأدوات المستخدمة في هذه المقالة ، بما في ذلك Coot و Refmac533،34،35،36 و Servalcat و phenix.real_space_refine وما إلى ذلك. وبالمثل ، توفر Chimera37 و ChimeraX38 تراخيص مجانية للمستخدمين الأكاديميين.

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>اتحاد العديد من المعاهد</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>مجاني للمستخدمين الأكاديميين ويتضمن Coot وقائمة الأدوات المطورة لعلم البلورات بالأشعة السينية</td></tr><tr><td>CCP-EM</td><td>Consortium من العديد من المعاهد</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>مجاني للمستخدمين الأكاديميين ويشمل Coot و Relion والعديد من الآخرين</td></tr><tr><td>Coot & nbsp.</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> <td>برنامج عام لبناء النموذج ولكنه متاح أيضا مع الأجنحة الأخرى الموضحة أعلاه</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>اتحاد العديد من المعاهد</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>البرمجيات داخل مجموعة Phenix لرسو النموذج في خرائط cryoEM</td></tr><tr><td>بنك بيانات المجهر الإلكتروني &nbsp;</td><td>اتحاد عدة معاهد</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td> مستودع <td>عام لخرائط المجهر الإلكتروني</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>تجاري ، كاميرا من Thermo Fisher &nbsp ؛</td></tr><tr><td>فينيكس&nbsp;</td><td>اتحاد العديد من المعاهد</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>مجاني للمستخدمين الأكاديميين ويتضمن</td></tr> اتحاد <tr><td>بنك بيانات بروتين</td> Coot <td>المكون من العديد من المعاهد</td><td>https://rcsb.org</td><td>قاعدة بيانات عامة للهياكل الجزيئية</td></tr><tr><td>الكبيرة Pymol</td><td>Schrodinger</td><td>https://pymol.org/2/</td> <td>أداة المحاكاة الجزيئية. النسخة التعليمية مجانية ولكنها تأتي مع قيود. يمكن الحصول على النسخة الكاملة برسوم رمزية.</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB ، برنامج Cambridge</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>لمعالجة الصور cryoEM ، متاح أيضا مع CCP-EM</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp ؛</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp; gad_source=1& gclid = CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>تجاري ، cryoTEM من Thermo Fisher</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>برنامج للأغراض العامة للعرض والتحليل والمزيد</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td></td> <td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/برامج الأغراض العامة للعرض والتحليل والمزيد</td></tr></tbody></table>

نمذجة الروابط في الخرائط المشتقة من المجهر الإلكتروني بالتبريد

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

يعد فك رموز تفاعلات البروتين والليجند في مركب جزيئي كبير أمرا بالغ الأهمية لفهم الآلية الجزيئية والعمليات البيولوجية الأساسية وتطوير الأدوية. في السنوات الأخيرة ، ظهر المجهر الإلكتروني للعينة المبردة (cryoEM) كتقنية قوية لتحديد هياكل الجزيئات الكبيرة والتحقيق في طريقة ربط الربيطة بدقة شبه ذرية. غالبا ما يكون تحديد ونمذجة الجزيئات غير البروتينية في خرائط cryoEM أمرا صعبا بسبب الدقة متباينة الخواص عبر الجزيء محل الاهتمام والضوضاء المتأصلة في البيانات. في هذه المقالة ، يتم تعريف القراء على العديد من البرامج والأساليب المستخدمة حاليا لتحديد الليجند ، وبناء النماذج ، وتحسين الإحداثيات الذرية باستخدام جزيئات كبيرة مختارة. تتمثل إحدى أبسط الطرق لتحديد وجود الرباط، كما هو موضح بإنزيم الإنولاز، في طرح الخريطتين اللتين تم الحصول عليهما مع الربيطة وبدونها. من المرجح أن تبرز الكثافة الإضافية لليجند في خريطة الاختلاف حتى عند عتبة أعلى. هناك حالات ، كما هو موضح في حالة مستقبلات الغلوتامات الأيضية mGlu5 ، عندما لا يمكن إنشاء خرائط الفرق البسيطة هذه. يمكن أن تكون الطريقة التي تم إدخالها مؤخرا لاشتقاق خريطة حذف Fo-Fc بمثابة أداة للتحقق من وجود الرباط وإثباته. أخيرا ، باستخدام β-galactosidase المدروس جيدا كمثال ، يتم تحليل تأثير الدقة على نمذجة الروابط وجزيئات المذيبات في خرائط cryoEM ، ويتم تقديم نظرة عامة حول كيفية استخدام cryoEM في اكتشاف الأدوية.

يقدم هذا البروتوكول الأدوات المتاحة لنمذجة الروابط ذات الجزيئات الصغيرة في خرائط cryoEM للجزيئات الكبيرة.

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

نحن مهتمون بفهم العمليات الفسيولوجية التي تحدث عبر الخلية ، خاصة عند واجهة الغشاء. نحن نستخدم Cryo-EM كتقنية رئيسية ونعمل على العديد من المشكلات البيولوجية المثيرة للاهتمام والصعبة التي تدرس مجمعات جزيئية متعددة. كان تحديد هياكل البروتينات الغشائية وغيرها من المجمعات القابلة للذوبان أمرا صعبا قبل عقدين من الزمن.ومع ذلك ، فإن التقدم التقني في Cryo-EM ، وهو منظف جديد ومحاكاة للدهون ومع الأوقاف مهد الطريق لتحديد الهيكل السريع لهذه المجمعات. يمكن الآن الحصول على هذه الهياكل بدقة عالية ويحتمل استخدامها في اكتشاف الأدوية. في جسيم واحد Cryo-EM ، تشمل التحديات الحصول على عينة مستقرة ومتجانسة ، وتضمين العينة في اتجاه عشوائي في الجليد الرقيق ، ومعالجة عدد كبير من الصور مع انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، وتحديد الاتجاه الزاوي والتصنيف بدقة أثناء إعادة بناء 3D.يعد تحديد ونمذجة الجزيئات الصغيرة في خرائط cryo-EM لمجمعات بروتين الليجند أمرا صعبا بسبب الضوضاء المتأصلة في البيانات ودقة الخريطة الخواص المنخفضة ، وعدم تجانس العينة ، ومرونة اليجند. هذا البروتوكول هو دليل خطوة بخطوة لتحديد ونمذجة الروابط وجزيئات المذيبات في Cryo-EM منخفض إلى متوسط الدقة.

modeling-ligands-into-maps-derived-from-electron-cryomicroscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

تحليل الجسيمات المفردة في المجهر الإلكترون المبرد هو واحد من التقنيات الرئيسية المستخدمة لتحديد بنية الفرق البيولوجية بدقة عالية. Scipion يوفر الأدوات اللازمة لإنشاء خط أنابيب كامل لمعالجة المعلومات التي تم الحصول عليها من المجهر وتحقيق إعادة بناء 3D من العينة البيولوجية.

Cryo-EM وتحليل الجسيمات المفردة مع Scipion

أصبح تحديد هيكل المجمعات الجزيئية الكبيرة باستخدام cryoEM روتينيا لفئات معينة من البروتينات والمجمعات. هنا، يتم تلخيص هذا الخط (إعداد العينات، والفحص، والحصول على البيانات ومعالجتها) ويتم توجيه القراء نحو المزيد من الموارد التفصيلية والمتغيرات التي يمكن تغييرها في حالة العينات الأكثر تحديا.

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

مهارة رئيسية في النمذجة الجزيئية الحيوية هو عرض والتعليق على المواقع النشطة في البروتينات. وقد أثبتت هذه التقنية باستخدام أربعة برامج شعبية مجانية للتصور الجزيئي الكلي: iCn3D، Jmol، PyMOL، وUCSF ChimeraX.

نمذجة موقع نشط إنزيم باستخدام التصور الجزيئي مجانية

تقدم هذه الورقة بروتوكول لمعالجة الصور البرد إم باستخدام مجموعة البرامج سفير. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على ما يقرب من جميع المشاريع إم الجسيمات واحد التي تستهدف قرار شبه الذرية.

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

نقدم بروتوكول لتوصيف الجزيئية البيولوجية قابلة للطي وملزمة التفاعلات مع يغاندس ثيرمولابيلي باستخدام القياس فرق المسح السريع.

قياس الملامح الجزيئية البيولوجية DSC مع يغاندس ثيرمولابيلي لوصف سرعة قابلة للطي والربط التفاعلات

بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات أسلوب ثبت لاكتشاف ببتيد تقارب الكواشف، بديلاً قويا للأجسام المضادة. وقد تبسيط أسلوب الفرز شبه الآلي هنا بيوبانينج لتقليل حدوث إيجابيات كاذبة. نحن هنا لتوضيح عملية التفكير والتقنيات المطبقة في تقييم المرشحين والتقليل من تحليل المتلقين للمعلومات.

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

نقدم هنا بروتوكولا لرصد الجمعية والتفكيك من توكسين الأنثراكس باستخدام قياس التداخل بيولايير (BLI). بعد التجميع/التفكيك على سطح بيوسينسور، تصدر مجمعات البروتين الكبيرة من على سطح الأرض للتصور وتحديد مكونات المجمعات باستخدام المجهر الإلكتروني والطيف الكتلي، على التوالي.

تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

المقدمة هنا هي اثنين من الأساليب التي يمكن استخدامها منفردة أو مجتمعة لتحليل أثر بيتا-اميلويد على هيكل فيبرينوجين جلطة. وشملت بروتوكول لإنشاء في المختبر فيبرينوجين جلطة، تليها التعكر تجلط والمجهر الإلكتروني المسح أساليب.

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

يصف هذا البروتوكول إزالة الدهون الذاتية من مسببات الحساسية ، واستبدالها بالليجاندات المحددة من قبل المستخدم من خلال HPLC في المرحلة العكسية إلى جانب التلين الحراري. 31 P-NMR و dichroism دائرية تسمح لتأكيد سريع لإزالة ليجند / التحميل، واستعادة بنية مسببات الحساسية الأصلية.

إزالة واستبدال الليغندات الذاتية من البروتينات والمواد المسببة للحساسية المرتبطة بالدهون

هنا ، نصف الإجراءات التي تم تطويرها في مختبرنا لإعداد مساحيق بلورات الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED).

حيود الإلكترون الجهورالوفولفي للجزيئات الصغيرة

اكتشف نمذجة الروابط الصغيرة في خرائط المجهر الإلكتروني بالتبريد باستخدام تقنية الجسيمات المنفردة. تُحسّن هذه الطريقة فهم تراكيب البروتينات الغشائية وتسريع اكتشاف الأدوية.

نمذجة الروابط في الخرائط المشتقة من المجهر الإلكتروني بالتبريد

استكشف المزيد من الفيديوهات