الجمع بين أوبتوجينيتيكس ميكرورناس الاصطناعية لتوصيف "تأثيرات الجينات ضربة قاضية" في وظيفة Presynaptic داخل "الدوائر العصبية سليمة"

الهدف العام من الجمع بين تداخل الحمض النووي الريبي بوساطة الحمض النووي الريبي الميكرو الاصطناعي مع علم البصريات الوراثي هو توصيف تأثير ضربة قاضية للجينات على وظيفة ما قبل المشبكي داخل الدوائر العصبية السليمة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فسيولوجيا التشابك ، مثل معالجة الدور الفسيولوجي للبروتينات قبل المشبكية في دوائر الدماغ السليمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجعل من الممكن مراقبة الإرسال المشبكي بشكل انتقائي في الخلايا العصبية ذات التعبير المنخفض عن البروتين قبل المشبكي قيد التحقيق.

أيضا ، استخدمنا هذه الطريقة للتحقيق في وظيفة ما قبل المشبكي في شرائح الدماغ الحادة. يمكن أيضا تطبيقه للتلاعب بالأمن العصبي واستكشافه في الجسم الحي. ستظهر الإجراء كارميلا فيتالي ، طالبة دراسات عليا من مختبرنا.

بعد تصميم الحمض النووي الريبي الصغير وبناء ناقل مؤتلف للتعبير عن الحمض النووي الريبي الميكرو ومسبار البصريات الوراثي ، قم بإعداد الثقافات العصبية الأولية من منطقة الدماغ ذات الأهمية. للقيام بذلك ، اتبع بروتوكول زراعة الشعر القائم من قبل L.A.Cingolani and Company مع التعديلات التالية. أولا ، استخدم لوحات من ستة آبار ، ونصف مليون خلية عصبية لكل بئر ، واستخدم 2.5 مل من وسط التعلق لكل بئر.

بعد احتضان اللوحة لمدة أربع ساعات ، قم بالتبديل إلى 3.3 مل من وسط الصيانة لكل بئر ، وإذا لوحظ فرط نمو الخلايا النجمية ، أضف 0.5 مل من وسط الصيانة المكمل ب 7.5 ميكرومولار من AraC في ثلاثة إلى أربعة DIVs. في خمسة إلى ستة DIVs ، قم بإصابة ثلاثة آبار لكل microRNA لاختبارها. استخدم أقل جرعة معدية تصيب ما لا يقل عن 99٪ من الخلايا العصبية.

أضف الفيروس مباشرة إلى الخلايا العصبية ، واخلطها برفق ، ثم ضع الألواح مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. في 17 إلى 18 DIVs ، قم بتحلل الخلايا العصبية لاستخراج الحمض النووي الريبي. قم بإمالة الألواح واستخدم الماصات الزجاجية لإزالة كل الوسط من كل بئر.

ثم أضف على الفور 700 ميكرولتر من كاشف التحلل إلى كل بئر. بعد خلط قصير ، انقل خلية المحللة من كل بئر وإلى أنابيب منفصلة سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 140 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل محللة.

بتغطية الأنابيب ورجها بسرعة لمدة 15 ثانية لاستحلاب المحتويات. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 12،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم انقل بعناية المرحلة المائية العلوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جديد.

لا تدع طرف الماصة يلمس المرحلة العضوية. أضف إلى المرحلة المائية 1.5 حجما من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وقم بماصة المحلول ببطء ثلاث مرات للخلط. بعد ذلك ، قم بتنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا ، وحدد كمية الغلة.

توقع ما لا يقل عن 3.5 ميكروغرام لكل عينة. يجب أن تكون نسب النقاء على البروتينات والمركبات العضوية 1.9 على الأقل. بعد ذلك ، استخدم مجموعة لنسخ 250 أو 500 أو 1 ، 000 نانوجرام من الحمض النووي الريبي.

بعد ذلك ، حدد كفاءة الضربة القاضية للجين الذاتي ذي الأهمية بواسطة RTPCR الكمي. تهدف إلى كفاءة ضربة قاضية لا تقل عن 60٪بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم تم حقن RAAV12 في الدماغ قبل 15 يوما أو أكثر وفقا لبروتوكول نشر سابقا من قبل A.Cetin and Company. اعزل الدماغ ، وقم بعمل شرائح دماغية حادة باستخدام اهتزاز وغاز ACFF مثلج بارد.

اجمع شرائح المنطقة محل الاهتمام ، وقلل من تعرضها للضوء لتجنب تنشيط المسبار البصري الوراثي. دع الشرائح تتعافى لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في نفس ACFF. استخدم غرفة مصممة خصيصا لحمل شرائح الدماغ.

بعد ذلك ، أعد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة ، حيث ستبقى صحية لمدة ست إلى ثماني ساعات. للمتابعة ، انقل شريحة إلى غرفة التسجيل ، وقم بدمجها بسرعة ملليلترين في الدقيقة من ACFF. بعد ذلك ، تحقق لفترة وجيزة من إشارة مراسل الفلورسنت المعبر عنه للتأكد من توطين وشدة العدوى.

ثم املأ قطبا كهربائيا بالمحلول داخل الخلايا. الآن ، تحت إضاءة الأشعة تحت الحمراء ، احصل على تكوين بالجملة محكم الغلق على خلية عصبية تتلقى مدخلات متشابكة من الخلايا العصبية المصابة. يمكن ترك مقاومة السلسلة دون تعويض ، ولكن يجب أن تكون ثابتة ومنخفضة.

على سبيل المثال ، إذا أصيبت الخلايا العصبية الهرمية CA3 ، فقم بتصحيح الخلايا العصبية الهرمية في السبيل الإنسي القريب إلى الإنسي لمنطقة CA1. عندما تبدأ الخلايا في الظهور بمظهر منكمش أو منتفخ ، أو عندما يصبح الترقيع صعبا ، أو تكون الدفعات غير مستقرة ، فإن الشرائح المحددة لم تعد صحية بما يكفي للتسجيل منها. بعد ذلك ، استخدم علم الأدوية لعزل التيارات المشبكية قيد التحقيق.

على سبيل المثال ، إذا كان الهدف هو التحقيق في الانتقال المشبكي الاستثاري ، فقم بمنع الانتقال المشبكي المثبط عن طريق إضافة bicuculline إلى الحمام. بعد ذلك ، استحضر التيارات المشبكية ، مثل التيارات المثيرة بعد المشبكي ، باستخدام ليزر أزرق 473 نانومتر مقترنا بألياف ضوئية موضوعة على سوماتا الخلايا العصبية المصابة. لا توجه الليزر إلى محاور الخلايا العصبية.

على سبيل المثال ، تجنب تسليط الضوء على ضمانات شافر. إزالة الاستقطاب المباشر للمحاور غير مرغوب فيه. بعد ذلك ، اضبط طول التحفيز إلى الحد الأدنى لتقليل إمكانية استحضار أكثر من جهد فعل واحد لكل نبضة ضوئية.

بعد ذلك ، قم بتحسين شدة الليزر لاستحضار تيار متشابك صغير ولكن يمكن اكتشافه بوضوح. على سبيل المثال ، بالنسبة للانتقال المشبكي الاستثاري بين الخلايا العصبية الهرمية CA3 و CA1 ، اضبط شدة الليزر لاستحضار التيارات المشبكية من 20 إلى 50 بيكوأمبير. في نهاية التجربة ، استخدم السموم الرباعية عند 0.5 ميكرومولار لسد قنوات الصوديوم.

تشير حساسية التيارات التي يتم استثارتها بصريا إلى السموم الرباعية إلى أنها مدفوعة بجهد العمل. استمر في جمع البيانات حتى يتم تصحيح ما لا يقل عن ثماني خلايا عصبية لحالة معينة من ثلاثة مختلفة على الأقل. هذا هو الحد الأدنى من البيانات اللازمة لتحليل النتائج.

باستخدام الطريقة الموصوفة ، تم هدم الأشكال الإسوية البديلة للوصلة لقنوات الكالسيوم ذات الجهد المبسور من النوع P / Q قبل المشبكي. يعتقد أن هذه القنوات تنظم اللدونة المشبكية قصيرة المدى في المشابك الاستثارية CA3 إلى CA1. تم عمل أربعة تركيبات مختلفة تعبر عن microRNAs الخاصة بالشكل الإسوي. تم التعبير عن كل منها مع قناة رودوبسين فائقة السرعة جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورسنت Td-Tomato.

أولا ، تم التأكيد على أن كل بناء يتمتع بكفاءة ضربة قاضية كافية وانتقائية في الثقافات العصبية الأولية للفئران باستخدام RTPCR الكمي الخاص بالشكل الإسوي. بعد ذلك ، تم حقن كل بناء في الحصين لفئران P18. في النهاية ، تم التحقيق في تأثير التركيبات على اللدونة المشبكية قصيرة المدى في المشابك CA3 إلى CA1 عن طريق تحفيز الخلايا العصبية الهرمية CA3 المصابة بنبضات قصيرة من ضوء 473 نانومتر وعن طريق تسجيل EPSCs الناتجة في تكوين بالجملة من الخلايا العصبية الهرمية في منطقة CA1.

أثرت ضربة قاضية من الأشكال الإسوية المختلفة للوصلة على الاستجابات لتحفيز النبض المزدوج في اتجاهين متعاكسين. ضربة قاضية من A إسوي الشكل تعزيز تسهيل النبض المزدوج; في حين أن ضربة قاضية من الشكل إسوي B ألغاها. يسمح الجمع بين تداخلات الحمض النووي الريبي وعلم البصريات الوراثي للبحث في مجال فسيولوجيا التشابك لاستكشاف كيفية تنظيم البروتينات قبل المشبكية اللدونة المشبكية قصيرة المدى في الدوائر السليمة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقق من صحة microRNAs لتداخل الحمض النووي الريبي وكيفية دمجها مع علم البصريات الوراثي للتحقيق في الانتقال المشبكي في شرائح الدماغ الحادة.