May 22nd, 2018
يمكننا وصف أسلوب التحقيق في القدرة على نصيحة زراعة الخلايا النباتية، بما في ذلك أنابيب حبوب اللقاح، وجذور الشعر، وموس بروتونيماتا، تمديد عبر الفجوات ضيقة للغاية (~ 1 ميكرومتر) في جهاز موائع جزيئية.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية النباتية ، مثل كيفية اختراق الخلايا النباتية التي تنمو الأطراف للحواجز الفيزيائية للخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على الحصول على صور عالية الدقة تعيد بناء عملية تشوه الخلية عند فجوة مقياس ميكرومتر تحت المجهر التقليدي. لصنع جهاز لفحص أنابيب حبوب اللقاح المتنامية والبروتونيماتا الطحالبية ، قم أولا بعمل ما يقرب من 11 جراما من PDMS ، وقم بتحميله في قالب بحجم أربع بوصات.
ثم قم بإزالة القالب لمدة 20 دقيقة في غرفة مفرغة. بعد ذلك ، قم بمعالجة القالب عند 65 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بمجرد المعالجة ، انزع طبقة PDMS من القالب ، وافتح فتحات الوصول إلى القناة داخل PDMS باستخدام أداة ثقب الخزعة.
بعد ذلك ، قم بتعريض PDMS والطبق الزجاجي الذي يبلغ طوله خمسة سنتيمترات لبلازما الهواء لمدة 50 ثانية. لإغلاق شبكة الموائع الدقيقة ، اضغط على طبقة PDMS على الطبق الزجاجي ، وقم بمعالجتها لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. لصنع جهاز دقيق مصمم لفحص شعر الجذور ، يتم تحميل قالبين ومعالجتهما.
عند تثقيب فتحات القناة ، استخدم لكمة ملليمترية. بعد تعريض كلتا الطبقتين لبلازما الهواء لمدة 50 ثانية ، انضم إليهما معا ، بما في ذلك غطاء ، تحت مجهر مجسم. استخدم أداة التقويم المصممة خصيصا لتحقيق ذلك.
قم بمعالجة التجميع لمدة 30 دقيقة في الفرن لإغلاق شبكة الموائع الدقيقة. بعد المعالجة ، قم بإزالة الغطاء من الجهاز ، وانقله إلى طبق زجاجي يبلغ طوله خمسة سنتيمترات. قبل استخدام الجهاز الدقيق لأنبوب حبوب اللقاح ، قم بتفريغه في غرفة مفرغة لمدة 20 دقيقة.
أضف وسط النمو إلى مدخل المدقة باستخدام ماصة دقيقة الرؤوس. قم بتحميل الآبار الأخرى بنفس الوسط. اترك بضع دقائق حتى تمتلئ القنوات.
في هذه الأثناء ، ضع منشفة ورقية مبللة في الطبق للمساعدة في الحفاظ على الرطوبة المحلية. الآن ، اجمع حبوب اللقاح من زهرة T.fournieri الزرقاء والبيضاء. انقل الحبوب إلى وصمة العار باستخدام إبرة تشريح.
بعد ذلك ، قم بقص نمط تلقيح بطول سنتيمتر واحد بالطول ، ثم أدخل نمط القطع في مدخل جهاز الموائع الدقيقة. عندما يتم إدخال نمط القطع في مدخل جهاز الموائع الدقيقة باستخدام ملاقط ، من المهم عدم تثبيت النمط بإحكام شديد لأنه قد يتلف النمط. بعد ذلك ، قم بتثبيت غطاء على الطبق باستخدام شريط لاصق ، وانقل الطبق إلى حاضنة على حرارة 28 درجة مئوية حيث يجب أن يبقى في الظلام لمدة خمس إلى ست ساعات.
العمل تحت غطاء التدفق الصفحي ، ابدأ بتعقيم بذور A.thaliana Columbia المعدلة وراثيا. انقعها في محلول التنظيف لمدة خمس دقائق. ثم اشطف البذور بالماء المعقم جيدا.
بمجرد تعقيمها ، قم بتخزين البذور عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 48 ساعة. بعد بضعة أيام ، قم بإزالة الجهاز الدقيق لمدة 20 دقيقة قبل استخدامه. بعد ذلك ، قم بتحميل وسط النمو المناسب في آبار الجهاز باستخدام ماصة ذات رأس دقيق ، وانتظر بضع دقائق حتى يتم سحب المحلول عبر جميع القنوات.
أيضا ، قم بتحميل بعض المناشف الورقية المبللة على الطبق للحفاظ على الرطوبة. الآن ، انقل بذرة محضرة إلى مدخل الجهاز. بعد ذلك ، قم بتأمين الغطاء باستخدام شريط لاصق ، وانقل الطبق إلى حاضنة 22 درجة مئوية مع ضوء مستمر.
قبل استخدامه ، قم بتعقيم الجهاز الدقيق تحت الأشعة فوق البنفسجية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإزالة الجهاز الدقيق لمدة 20 دقيقة. بمجرد تفريغ الغاز ، قم بتحميل الآبار الصغيرة بوسط النمو المناسب.
بينما تمتلئ القنوات تدريجيا ، أحيط الجهاز الدقيق ببعض الماء المعقم للحفاظ على الرطوبة. انقل قطعة صغيرة من أنسجة البروتونيماتا الطحالبية إلى مدخل الجهاز الدقيق. الآن ، قم بزراعة الجهاز عند 25 درجة مئوية تحت ضوء مستمر.
بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من النمو ، التقط صورا ساحقة للنتائج تحت المجهر. تواجه الخلايا النباتية التي تنمو في الطرف سلسلة من الحواجز المادية على طول مسارات نموها في الجسم الحي ، كما هو الحال في الجهاز الناقل وعند micropyle ، ناهيك عن مسار شعر الجذور في التربة. تتيح منصات زراعة الخلايا في المختبر المعروضة فحص عملية نمو الأطراف في ثلاثة أنواع من الخلايا النباتية وأنابيب حبوب اللقاح وشعر الجذور والبروتونيماتا الطحالبية.
يتم المشاهدة من خلال فجوات ميكرون واحد في الأجهزة. نظرا لأن الفجوات الصغيرة بهذا الحجم هشة ، فإنها تغلق في بعض الأحيان ، خاصة بعد الاستخدام المتكرر. وبالتالي ، من المهم التحقق من أن الفجوات سليمة قبل إجراء التجارب.
بالنسبة لدراسة أنبوب حبوب اللقاح ، تم استخدام تصوير الخلايا الحية لمراقبة التغيرات المورفولوجية في المنطقة القمية لأنابيب حبوب اللقاح ، وكذلك النواة الخضرية وخلايا المنوية استجابة لمواجهة مساحة صغيرة للغاية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا النباتية لاستكشاف قدرة الاستطالة للخلايا النباتية المتنامية ، مثل أنابيب حبوب اللقاح وشعر الجذور والطحالب البروتونيتا في مساحة صغيرة للغاية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
تصف هذه المقالة طريقة للتحقيق في قدرة الخلايا النباتية المتزايدة على الأطراف على التمدد من خلال فجوات ضيقة في جهاز ميكروفلويديك. تتيح التقنية تصويرًا عالي الدقة لعمليات تشوه الخلايا على مقياس الميكرومتر.
Studying tip-growing plant cell behavior in physically constrained environments provides mechanistic insights into cellular adaptation under mechanical stress, relevant for understanding growth regulation in complex tissues. This microfluidic platform enables high-resolution visualization of subcellular dynamics during barrier penetration, supporting hypothesis testing in cellular mechanics and predictive modeling of growth responses. The approach offers a scalable in vitro system to de-risk target validation in plant developmental pathways by linking physical constraints to molecular readouts.
The microfluidic elongation assay fits within early discovery workflows where understanding cellular responses to physical cues informs target selection and pathway validation.