جهاز ميكروفلويديك لدراسة سلالات متميزة متعددة

الهدف العام من الطريقة التالية هو تصوير سلوك الخلايا المفردة من سلالات مختلفة من الخميرة في ظل نفس الظروف الديناميكية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع جهاز ميكروفلويديك من طبقتين ، أو ستحتوي الطبقة السفلية على كل من السلالات المختلفة على حدة ، وستوفر الطبقة العليا ظروف التدفق الديناميكي كخطوة ثانية. يتم وضع سلالات خميرة مختلفة في الآبار ويتم إغلاق الجهاز ، مما يخلق قناة واحدة ذات سلالات منفصلة متعددة.

بعد ذلك ، نقوم بتصوير استجابات الخلية لتغيرات الوسط الديناميكي من خلال التحكم في معدلات التدفق في مدخلي القناة Y ، تظهر النتائج سلالات مختلفة معرضة لنفس الظروف الديناميكية وعدم وجود تلوث متبادل بين الآبار. يتميز جهاز الموائع الدقيقة هذا بالعديد من المزايا الرئيسية مقارنة بالأنظمة الأخرى الموجودة. يسمح بتصوير سلالات متميزة متعددة في ظل نفس الظروف الديناميكية.

أيضا ، الأهم من ذلك ، يمكن تصنيعها بسهولة في أي مختبر دون الحاجة إلى معدات خاصة. جاءت هذه الطريقة من مناقشة حول كيفية متابعة استجابات عزلات الشرق البري المختلفة لتمريرات الجوع. ابدأ تخطيط القناة الدقيقة المطلوب أو ارسم أو اطبعه لتوسيع نطاقه.

بعد ذلك ، قم بتغطية شريحة زجاجية بطبقات من الشريط اللاصق لتحقيق الارتفاع المطلوب للقناة ، ضع تصميم التخطيط على سطح مستو وقم بمحاذاة الشريحة فوق نمط التصميم. الآن قم بقص الشريط بعناية على الشريحة الزجاجية وفقا للتخطيط. قم بإزالة الشريط اللاصق من جميع مناطق الشريحة الزجاجية.

اقبل تلك الموجودة في تخطيط القناة الصغيرة. ضع الشريحة في فرن تسخين 65 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم نظف برفق باستخدام الإيثانول.

امزج مكونات القاعدة والمعالجة من PDMS على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. صب حوالي 30 مل من خليط PDMS في طبق بتري على ارتفاع حوالي 0.5 سم. قم بإزالة PDMS في الفراغ إذا لزم الأمر.

اغمر الشريحة الزجاجية في نظام PDMS بحيث يكون الشريط اللاصق المزخرف متجها لأعلى. يمنع وضع النمط بعد PDMS تكوين فقاعات الهواء بين الشريحة والطبق علاج القاع لمدة 48 ساعة عند 65 درجة مئوية ، مع التأكد من أن الطبق أفقي باستخدام مستوى فقاعة في طبق بتري جديد مقاس 90 ملم. صب ثلاثة ملليلتر من مزيج PDMS.

يمكن تنفيذ هذه الخطوة على مبرمج الدوران إذا كان ذلك متاحا. DGAs والعلاج كما هو موضح سابقا. الآن قم بقص طبقة التدفق لجهاز الموائع الدقيقة برفق إلى الحجم المطلوب باستخدام أداة ثقب الخزعة.

قم بإنشاء ثقوب للمداخل والمنافذ في طبقة التدفق. اقطع أيضا طبقة آبار متشابهة الحجم من طبق بتري الثاني وضعها على كوب سميك. مرر فوق تخطيط التصميم.

ثم قم بإخراج الآبار بمحاذاة مع القنوات الدقيقة على التصميم باستخدام الإيثانول ، وقم بتنظيف كل من طبقات PDMS وانزلاق الغطاء الزجاجي وجففه في الهواء. بعد ذلك ، عالج انزلاق الغطاء الزجاجي وطبقة الآبار PDMS إما بحفر البلازما القياسي للترابط غير القابل للانعكاس أو معالج الهالة المحمول للربط القابل للانعكاس. ضع طبقة الآبار بحذر أعلى زلة الغطاء لإحداث التصاق.

فرك أي فقاعات هواء برفق. قم بإعداد الوسائط المطلوبة في المحاقن المناسبة وتوصيلها بأنابيب tigon الملولبة من خلال مضخة حقنة. لتصوير الخلايا.

استخدم نقاط القوة. انتقل إلى المرحلة المطلوبة ، وقم بتدوير الثقافة بدقة ، ونقل 300 ميكرولتر إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة. ضع ميكرولتر واحد من con canna A برفق في كل بئر من طبقة آبار PDMS.

اغسل الكونا أ الزائدة من كل بئر مرتين عن طريق سحب الماء برفق أثناء تجفيف الخداع الموجود في A. اغسل السلالات مرتين ب 300 ميكرولتر من وسط SC الذي يفتقر إلى الجلوكوز. يساعد غسل الجلوكوز المتبقي من جدران الخلايا على الالتزام السليم بالصلاحية.

في ما بعد الدوامة ، تقوم الخلايا بعمل ماصة كاملة حوالي 0.5 ميكرولتر من تعليق الخلية في الآبار الفردية. اغسل الخلايا المتبقية برفق بوسط غني. يجب تنفيذ الخطوتين التاليتين بسرعة لمنع الخلايا من الجفاف.

كخطوة اختيارية للبلازما ، عالج الرقاقة والآبار مع الحرص على عدم ضرب الآبار مباشرة. ثم تحت مجسم ، ضع الرقاقة بعناية على الآبار مع إيلاء اهتمام وثيق للمحاذاة بين الاثنين. اضغط برفق للالتصاق بطبقتين من PDMS.

املأ الجهاز ببطء بالكامل بحوالي 50 ميكرولترا من الوسط الغني ، مع التأكد من عدم ترك فقاعات هواء داخل القناة. الآن قم بتوصيل الجهاز الذي يقوم بإدخال الأنابيب في المداخل المناسبة وبدء تدفق الوسائط. احرص على عدم تشكل فقاعات هواء في الأنبوب حيث يمكن أن تعلق في الجهاز وتدمر التدفق.

تابع وضع الجهاز تحت المجهر وابحث عن نقاط التصوير المناسبة في كل منها. حسنا ، حافظ على الخلايا تحت تدفق غني ومتوسط لمدة ساعة واحدة أو أكثر إذا لزم الأمر. للسماح بالتعافي.

ابدأ التجربة بإعداد التدفق المستمر. المضخة A إلى 0.8 مل في الساعة والمضخة B إلى 0.2 مل في الساعة. بالنسبة للمتوسط يتدفق أكثر من 80٪ من عرض القناة.

يمكننا تغيير الظروف في الجهاز ديناميكيا عن طريق تغيير معدلات التدفق النسبية. تستقر الظروف الجديدة في غضون ثوان على طول القناة بأكملها لإثبات الفصل بين السلالات المختلفة. يتم تصوير سلالتين مميزة من الخميرة في آبار بديلة.

لاحظ أنه لا يوجد تسرب خلوي بين الآبار في هذه التجربة. تحتوي كلتا السلالتين على عامل النسخ MSN الثاني الموسوم ب YFP لاختبار التأثير المتزامن للظروف المتغيرة ديناميكيا. تم تغيير معدلات التدفق في قناتي الإدخال لإنشاء خطوة بدون وسط جلوكوز.

أدى ذلك إلى توطين MSN اثنين إلى النواة. الأهم من ذلك ، يمكن تحليل المسار الزمني ل MSN النووي مستويين من YFP في خلايا مفردة. لذلك يمكن استخدام جهاز الموائع الدقيقة PDMS لتطبيق الظروف الديناميكية المتزامنة على آبار متعددة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم ترك الخلايا تجف أثناء تجميع الجهاز. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بها بسهولة دون الحاجة إلى الطباعة الحجرية الناعمة.