Name: جهاز ميكروفلويديك لدراسة سلالات متميزة متعددة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: استكشف تصوير سلوك الخلايا الفردية من سلالات الخمائر المختلفة باستخدام جهاز ميكروفلويديك ثنائي الطبقات. يتيح هذا الأسلوب دراسة الاستجابات الديناميكية دون تلوث متبادل بين الآبار.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويدعم YG من قبل البنك الإسلامي للتنمية من الزمالة. IN هو زميل ألون وزميل كلية من ‭ J ادمون. ‬ الصفرا مركز المعلوماتية الحيوية في جامعة تل أبيب ‭. ‬ وأيد هذا البحث من قبل قوى الأمن الداخلي منحة 1499/10.

1. إنشاء ماجستير سكوتش الشريط 5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم أو طباعة تخطيط متناهية المطلوب، لتوسيع نطاق، على الورق. في حالتنا تصميم يتكون من قنوات على شكل Y اثنين، كل 3 مم واسعة (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية شريحة زجاجية مع طبقات من لاصق شفاف. فإن عدد طبقات تحديد ارتفاع لقناة (حوالي 60 ميكرون لكل طبقة). استخدمنا 3 طبقات لاصق شفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع تصميم تخطيط على سطح مستو. محاذاة الشريحة على نمط التصميم. قطع الشريط بعناية على الشريحة الزجاجية مع مشرط وفقا للتخطيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لاصق شفاف من جميع مناطق شريحة زجاجية باستثناء تلك في تخطيط متناهية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة في فرن التدفئة في C ° 65 لمدة 2-3 دقيقة. تنظيف بلطف مع الايثانول. </li></ol> 2. افتعال جهاز ميكروفلويديك PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط مكونات قاعدة وعلاج من PDMS على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. نستخدم 10:01نسبة إلى وكيل قاعدة المعالجة. صب حوالي 30 مل من خليط PDMS في طبق بتري إلى ارتفاع 0.5 سم ~. ديغا وPDMS في فراغ إذا لزم الأمر. غمر شريحة زجاجية في PDMS مع لاصق شفاف منقوشة مواجهة. وضع نمط بعد PDMS يمنع تشكيل فقاعات الهواء بين الشريحة وأسفل الطبق. علاج لمدة 48 ساعة في C ° 65، والتأكد من الطبق أفقيا باستخدام مستوى فقاعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في جديد 90 مم طبق بتري صب 3 مل من مزيج PDMS، مما أدى إلى طبقة عميقة حول 0.5 مم. (إذا كان متوفرا تدور المغطي، يمكن استخدامه لهذه المرحلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديغا وكما هو الحال في علاج 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض بلطف من الجهاز ميكروفلويديك إلى الحجم المطلوب مع مشرط. وسيتم وصف هذه الطبقة &quot;طبقة تدفق&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعة ذات الحجم المماثل من PDMS طبقة رقيقة من طبق بيتري الثاني. وسيتم وصف هذه &quot;الطبقة الآبار&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الناخس خزعة بحجم مناسب (نحن نستخدم 1،2 مم ID) لكمة ثقوب للمداخل ومنافذ في طبقة التدفق. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبقة الآبار على شريحة زجاجية سميكة على تخطيط وتصميم لكمة من الآبار، وذلك باستخدام 2 مم ID خزعة الناخس، بما يتماشى مع و microchannels على التخطيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف كل من طبقات PDMS فضلا عن 24 ملم × 60 ساترة الزجاج ملم مع الايثانول. الهواء الجاف والحفاظ عليها نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البلازما علاج كل من ساترة الزجاج وطبقة PDMS الآبار باستخدام إما مطبوع البلازما القياسية (لغير عكوس الربط) أو المفاوض باليد كورونا 6 لارتباط عكسها. وضع بعناية طبقة الآبار على رأس ساترة للتسبب التصاق (الشكل 3). فرك بلطف من أي فقاعات الهواء (إذا لزم الأمر). </li></ol> 3. خلية التصوير التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من وجود وسائل الإعلام المطلوب جاهزا في الحقن المناسبة لتوصيل أنابيب بلاستيكية مرنة مع القطر الداخلي قدرها 0.02 &quot;(Tygon) في مضخة الحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو S. سلالات خميرة إلى المرحلة المطلوبة في YPD السائل. دوامة بدقة ومكان 300 μل كل سلالة في أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف 1 ميكرولتر من A كونكانافالين (سيجما) 2 ملغ / مل في كل بئر. تغسل كونكانافالين الزائدة A مرتين من جانب كل من pipetting بلطف المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن A كونكانافالين والتجفيف، ويغسل مرتين مع 300 سلالات ميكرولتر من SC المتوسطة التي تفتقر إلى الجلوكوز. غسل الجلوكوز المتبقية من جدران الخلايا يساعد التقيد السليم إلى A. كونكانافالين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا دوامة بدقة. ماصة ميكرولتر 0.75 أو أقل من كل خلية في التعليق بشكل جيد الخاصة (الشكل 3). يغسل بلطف من الخلايا المتبقية مع المتوسط ​​الغنية. الخطوتين التاليتين تحتاج إلى القيام بها بسرعة من أجل منع الخلايا من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البلازما علاج رقاقة والآبار باستخدام بدقة المفاوض باليد كورونا، والحرص على عدم ضرب الآبار مباشرة. بعناية وضع رقاقة على الآبار، مع إيلاء اهتمام وثيق للمواءمة بين الاثنين (ويمكن أن يتم في إطار هذه الخطوة المجسام). اضغط بلطف على الالتزام طبقتين من PDMS. ملء ببطء الجهاز تماما مع متوسط ​​حوالي 50 ميكرولتر الغنية، والتأكد من عدم ترك أي فقاعات الهواء داخل القناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الجهاز أو إدخال الأنابيب في مداخل مناسبة وبدء تدفق وسائل الاعلام. رعاية التي يتم تقديمها أي فقاعات الهواء في الجهاز وهذه يمكن أن تكون خادعة لإزالة، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق قطع ومدخل أو مخرج والتنصت بلطف على الجهاز حيث الفقاعات هي، والحرص على عدم كسر الزجاج ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع تحت المجهر وإيجاد نقاط التصوير المناسبة في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على تدفق الخلايا تحت المتوسطة الغنية ل1 ساعة أو أكثر للسماح الانتعاش إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التجربة: نستخدم التدفق المستمر من كل من مضخات الحقن مرتين إلى منع وسائل الإعلام من ارتجاعي، وتغيير معدلات تدفق النسبية على النحو المرغوب فيه. وضع مضخة A إلى 0.8 مل / ساعة وB مضخة إلى 0.2 مل / ساعة في المتوسط ​​نتائج A تتدفق أكثر من 80٪ من عرض القناة (الشكل 4). هذا يمكن أن يكون ديناميكيا جشنق عن طريق تغيير معدلات تدفق اثنين. استقرار الأوضاع الجديدة في غضون ثوان على طول الكامل للقناة 2. </li></ol>

<ol><li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li>
<li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li>
<li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+%26+Tips%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips & Tips. , (2010).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذه الورقة نقدم طريقة بسيطة لإنشاء الفوق جهاز ميكروفلويديك تسمح التالية عدة سلالات الخميرة في وقت واحد في ظل ظروف دينامية. بعد عدة سلالات في قناة واحدة يوفر أداة موثوقة لمقارنة ديناميكية ردود خلية واحدة في سلالات متعددة. ميزة واحدة من نهجنا هو القدرة على افتعال الجهاز مع تقنيات بسيطة دون الحاجة لغرفة نظيفة. في الواقع، لقد قمنا أيضا إلى بروتوكول تخطي عمليات المعالجة البلازما (في الخطوات 2.9 و 3.6) وحصلت على نتائج جيدة، لذلك دون أي معدات مختبرات البلازما سيستمر في تنفيذ البروتوكو...

رد فعل الخلايا باستمرار مع البيئة المتغيرة بشكل حيوي، عن طريق تغيير عملية الأيض لديهم، لمحة النسخي والوظائف الخلوية. لدراسة هذه الظواهر، وهناك حاجة إلى تحديد الطرق التي يمكن أن مثل هذه التغييرات. نوع واحد من قراءات لهذه الاستجابات هو التغيير في توطين عوامل الإجهاد ذات الصلة في النسخ استجابة للضغوط الغذائية. وقد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك 1 إلى التلاعب حيوي الظروف البيئية إلى الخلايا 2-4. ما يقدمونه العديد من المزايا للتصوير الخلايا الحية: يمكن للبيئة من الخلايا تسيطر على وجه التحديد وبشكل حيوي تغيير؛ الخلايا يمكن أن تكون حية المصورة في جميع الأوقات، بما في ذلك خلال التلاعب في الظروف الخارجية، وهناك حاجة كميات ضئيلة كاشف. تصميم بسيط جدا لجهاز ميكروفلويديك، مما يسمح للاختلاف بين اثنين من الظروف، هو جهاز على شكل Y 2. نستخدم عادة على شكل Y الأجهزة ميكروفلويديك التي تسمحتطبيق التغيرات الدينامية إلى خلايا في القناة. نستخدم هذا الجهاز لمتابعة التغيرات توطين عوامل الإجهاد ذات الصلة الموسومة fluorescently النسخ في خلايا الخميرة. ونحن نتابع هذه التغييرات في إطار الظروف المتغيرة في مجال التغذية. على سبيل المثال، يمكننا توفير نبضة (أو سلسلة من النبضات) من الجلوكوز التي تحتوي على المتوسط ​​في غضون فترة لا الجلوكوز المتوسطة، في القرار ألف الزمنية ناعم جدا. في كثير من الأحيان في مثل هذه التجارب، هو واحد المهتمين في مقارنة ردود سلالات مختلفة من الخلايا (على سبيل المثال، المسوخ مختلفة، أو العزلات البرية مختلفة). يقتصر قناة Y على شكل لسلالة واحدة في كل قناة - إذا تم استخدام أكثر من سلالة واحدة، وليس هناك طريقة بسيطة للتمييز بين السلالات. للتغلب على هذه، يمكن استخدام قنوات مختلفة. إذا كنا نريد تطبيق نفس الشروط على ديناميات سلالات متعددة، نود أن تجمع بين مفهوم Y-القناة مع قنوات متعددة. هناك نوعان من التحديات في تنفيذ هذا الحل: يمكن أن يكون من الصعب تطبيق رانه نفس الظروف في نفس الوقت لجميع القنوات، وليس هناك وجود قيود هندسية لعدد من القنوات Y-التي يمكن تركيبها في جهاز واحد. لذلك كنا نبحث عن وسيلة لعرض عدة سلالات في قناة واحدة تحت ظروف ديناميكية. نحن هنا وصف جهاز ثنائي الطبقات ميكروفلويديك المعدة للسلالات متعددة التصوير في قناة واحدة في ظل الظروف الديناميكية نفسها. الطبقة السفلية تتكون من PDMS رقيقة مع صف من الثقوب. يتم إرفاق هذه الطبقة إلى ساترة الزجاج خلق الآبار التي سنقوم في وضع مختلف السلالات، والتمسك لهم كونكانافالين A على الزجاج. الطبقة الثانية عبارة عن جهاز على شكل Y ميكروفلويديك التي تم إنشاؤها باستخدام أسلوب لاصق شفاف 5. بعد وضع سلالات في الآبار يتم محاذاة بسرعة الطبقة الثانية والتي تعلق على أول واحد، وخلق قناة واحدة مع العديد من الآبار التي تحتوي على سلالات مختلفة. هذا الجهاز يسمح النهائي بعد عدة سلالات في قناة واحدة، حيث كلتتعرض سلالات لنفس الشروط في نفس الوقت بالضبط. ويمكن أن يتم تصميم عملية الإنتاج برمتها وعلى الفوق، وذلك باستخدام وسائل بسيطة، مع عدم وجود الطباعة الحجرية الناعمة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف / معدات </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> PDMS-184 SYLGARD </td><td> داو كورنينج USA </td><td></td></tr><tr><td> فراغ مجفف </td><td> Nalgene </td><td> 5310-0250 </td></tr><tr><td> خزعة المطارق </td><td> تيد بيلا شركة </td><td> هاريس أحادي النواة 15076 (2 مم)، 15074 (1.2 مم) </td></tr><tr><td> حقنة مضخات </td><td> Chemyx </td><td> الانصهار 200 </td></tr><tr><td> الاكليل المفاوض </td><td> تكنيك المنتجات الكهربائية </td><td> BD-20 </td></tr><tr><td> Tygon أنابيب </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> كونكانافالين-A </td><td> سيجما </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> سكوتش الشريط </td><td> 3M سكوتش </td><td> شفافية الشريط 1/2 &quot; </td></tr></tbody></table>

جهاز ميكروفلويديك لدراسة سلالات متميزة متعددة

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

دراسة استجابات الخلية إلى التغيرات البيئية يفرض تحديات تجريبية كثيرة: الخلايا تحتاج إلى تصوير تحت الظروف المتغيرة، وغالبا بطريقة نسبية. وتستخدم بشكل روتيني لوحات Multiwell لمقارنة سلالات مختلفة أو خطوط الخلايا، ولكن تسمح سيطرة محدودة على ديناميات البيئة. أجهزة ميكروفلويديك، من ناحية أخرى، تسمح التحكم الديناميكي رائعة على الظروف المحيطة بها، ولكنه يمثل تحديا لصورة وتميز أكثر من سلالات قليلة فيها. نحن هنا وصف الأسلوب بسهولة وبسرعة تصنيع جهاز ميكروفلويديك قادرة على تطبيق الظروف المتغيرة بشكل حيوي إلى عدة سلالات الخميرة متميزة في قناة واحدة. تم تصميم الجهاز وتصنيعها من قبل وسائل بسيطة دون الحاجة إلى الطباعة الحجرية الناعمة. وتتكون من قناة تدفق على شكل Y تعلق على الطبقة الثانية إيواء microwells. توضع في microwells سلالات منفصلة، ​​وتصويرها في ظل الظروف الدقيقة الحيوية نفسها. نحن التجريبيnstrate استخدام الجهاز لقياس ردود توطين البروتين لنبضات من التغييرات في المغذيات سلالات الخميرة مختلفة.

للتدليل على الفصل بين سلالات مختلفة تصوير نحن سلالتين الخميرة مميزة في الآبار بديلة. تصوير الآبار كامل لا يظهر أي تسرب خلية بين الآبار (5A الشكل، ب). كل سلالات لديها MSN2 عامل النسخ ذات الكلمات الدلالية مع YFP. لاختبار تأثير حيوي في وقت واحد لتغيير الأوضاع، تحولت لدينا معدلات تدفق في القنوات اثنين من المدخلات، وخلق خطوة متوسطة لا الغلوكوز، مما أدى إلى توطين Msn2-YFP إلى النواة (الشكل 5C، د). حدثت استجابة في قياس جميع الآبار في نفس الوقت، والتي تبي...

نقدم طريقة بسيطة لإنتاج أجهزة ميكروفلويديك قادرة على تطبيق شروط دينامية مماثلة لسلالات متميزة متعددة، دون الحاجة إلى غرفة نظيفة أو الطباعة الحجرية الناعمة.

تطرح دراسة استجابات الخلايا للتغيرات البيئية العديد من التحديات التجريبية؛ إذ تتطلب الخلايا التصوير تحت ظروف متغيرة، وغالبًا ما يكون ذلك في...

الهدف العام من الطريقة التالية هو تصوير سلوك الخلايا المفردة من سلالات مختلفة من الخميرة تحت نفس الظروف الديناميكية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع جهاز مائع دقيق مكون من طبقتين، حيث تحتوي الطبقة السفلية على كل سلالة من السلالات المختلفة بشكل منفصل، بينما توفر الطبقة العلوية ظروف التدفق الديناميكي كخطوة ثانية. يتم وضع سلالات الخميرة المختلفة في الآبار ثم يُغلق الجهاز، مما يؤدي إلى إنشاء قناة واحدة تحتوي على سلالات متعددة ومنفصلة.بعد ذلك، نقوم بتصوير استجابات الخلايا للتغيرات الديناميكية في الوسط. ومن خلال التحكم في معدلات التدفق في مدخلي القناة Y، تظهر النتائج سلالات مختلفة خضعت لنفس الظروف الديناميكية دون حدوث تلوث خلطي بين الآبار. يتميز هذا الجهاز الموائع الدقيقة بعدة مزايا رئيسية مقارنة بالأنظمة الحالية الأخرى؛ حيث يتيح تصوير سلالات متميزة متعددة تحت نفس الظروف الديناميكية.علاوة على ذلك، ومن المهم الإشارة إلى أنه يمكن تصنيعه بسهولة في أي مختبر دون الحاجة إلى معدات خاصة. وقد جاءت فكرة هذه الطريقة من مناقشة حول كيفية تتبع استجابات عزلات مختلفة من سلالات East البرية لدورات التجويع. في البداية، قم برسم أو طباعة المخطط المطلوب للقناة الدقيقة بمقياس رسم دقيق.بعد ذلك، قم بتغطية شريحة زجاجية بطبقات من الشريط اللاصق. وللوصول إلى الارتفاع المطلوب للقناة، ضع تصميم المخطط على سطح مستوٍ ومحاذِ الشريحة فوق نمط التصميم. الآن، قم بقص الشريط اللاصق الموجود على الشريحة الزجاجية بعناية وفقاً للمخطط. ثم قم بإزالة الشريط اللاصق من جميع مناطق الشريحة الزجاجية.يتم قبول تلك الموجودة في مخطط القناة الدقيقة. توضع الشريحة في فرن تسخين عند درجة حرارة 65 °C لمدة ثلاث دقائق، ثم تنظف بلطف باستخدام الإيثانول.امزج المكون الأساسي وعامل المعالجة لـ PDMS وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة. صب حوالي 30 milliliters من خليط PDMS في طبق بتري حتى يصل الارتفاع إلى 0.5 centimeters تقريباً. قم بإزالة الغازات من PDMS في الفراغ إذا لزم الأمر.اغمر الشريحة الزجاجية في PDMS بحيث يكون الشريط اللاصق المنقوش موجهاً للأعلى. إن وضع النمط بعد PDMS يمنع تكون فقاعات الهواء بين الشريحة وقاع الطبق. اتركها لتتصلب لمدة 48 ساعة عند 65 درجة مئوية، مع التأكد من أن الطبق في وضع أفقي باستخدام ميزان تسوية الفقاعات في طبق بتري جديد بقطر 90 مليمتر. صب ثلاثة مليلتر من خليط PDMS.يمكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام جهاز طلاء دوراني (spin coder) إذا كان متاحاً. يتم إجراء عملية إزالة الغازات (DGAs) والمعالجة كما هو موضح سابقاً. الآن، قم بقص طبقة التدفق لجهاز الموائع الدقيقة بعناية إلى الحجم المطلوب باستخدام خرامة خزعات (biopsy puncher).قم بعمل ثقوب للمداخل والمخارج في طبقة التدفق. كما يجب قص طبقة آبار ذات حجم مماثل من طبق بتري الثاني ووضعها على لوح زجاجي سميك. ثم قم بإزاحة مخطط التصميم فوقها.بعد ذلك، قم بتثقيب الآبار بما يتوافق مع القنوات الدقيقة الموجودة في المخطط باستخدام الإيثانول، ثم نظف كلتا طبقتي PDMS وشريحة الغطاء الزجاجية واتركهما لتجفا في الهواء. بعد ذلك، قم بمعالجة شريحة الغطاء الزجاجية وطبقة آبار PDMS إما باستخدام جهاز نقش البلازما القياسي للربط غير العكسي، أو باستخدام جهاز معالجة كورونا المحمول للربط العكسي. ضع طبقة الآبار بعناية فوق شريحة الغطاء لتحقيق الالتصاق.مع فرك أي فقاعات هوائية برفق لإزالتها. قم بتحضير الأوساط المطلوبة في محاقن مناسبة ووصلها بأنابيب tigon الممررة عبر مضخة محاقن. لتصوير الخلايا.استخدم القوى. انتقل إلى المرحلة المطلوبة، وقم برج المزرعة جيداً باستخدام جهاز Vortex، وانقل 300 µL إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة. ضع بلطف 1 µL من con canna A في كل بئر من طبقة آبار PDMS.اغسل الفائض من con A من كل بئر مرتين عن طريق سحب الماء بلطف بالماصة أثناء جفاف con A. اغسل السلالات مرتين باستخدام 300 µL من وسط SC الخالي من الجلوكوز. يساعد غسل الجلوكوز المتبقي من جدران الخلايا على الالتصاق السليم بـ conval.بعد الرج الدوامي، يتم سحب حوالي 0.5 µL من معلق الخلايا بدقة باستخدام الماصة وتوزيعها في آبار منفردة. تُغسل الخلايا المتبقية بلطف باستخدام وسط غذائي غني. يجب تنفيذ الخطوتين التاليتين بسرعة لمنع جفاف الخلايا.كخطوة اختيارية، عالج الشريحة والآبار بالبلازما مع الحرص على عدم توجيه البلازما نحو الآبار مباشرة. بعد ذلك، وتحت المجهر المجسم، ضع الشريحة بعناية فوق الآبار مع إيلاء اهتمام دقيق للمحاذاة بينهما. اضغط بلطف لالتصاق طبقتي PDMS.املأ الجهاز ببطء وبالكامل بنحو 50 microliters من الوسط الغني، مع التأكد من عدم ترك أي فقاعات هوائية داخل القناة. الآن قم بتوصيل الجهاز عن طريق إدخال الأنابيب في المداخل المناسبة وابدأ تدفق الوسط. احرص على عدم تكون فقاعات هوائية في الأنابيب لأنها قد تعلق داخل الجهاز وتؤدي إلى تعطيل التدفق.باشر بوضع الجهاز تحت المجهر وتحديد نقاط التصوير المناسبة في كل بئر، مع الحفاظ على تدفق الوسط الغني فوق الخلايا لمدة ساعة واحدة أو لفترة أطول إذا لزم الأمر، وذلك للسماح لها بالتعافي.ابدأ التجربة بضبط التدفق الثابت. اضبط المضخة A على 0.8 milliliters per hour والمضخة B على 0.2 milliliters per hour. بالنسبة للوسط، يجب أن يتدفق على أكثر من 80% من عرض القناة.يمكننا تغيير الظروف في الجهاز ديناميكياً عن طريق تغيير معدلات التدفق النسبية. وتستقر الظروف الجديدة في غضون ثوانٍ على طول القناة بأكملها. ولتوضيح الفصل بين السلالات المختلفة، يتم تصوير سلالتين متمايزتين من الخميرة في آبار متبادلة.لاحظ أنه لا يوجد تسريب للخلايا بين الآبار في هذه التجربة. كلا السلالتين لديهما عامل النسخ MSN2 المسمى بـ YFP لاختبار التأثير المتزامن للظروف المتغيرة ديناميكيًا. تم تغيير معدلات التدفق في قناتي الإدخال لإنشاء خطوة من الوسط الخالي من الغلوكوز.أدى ذلك إلى تموضع MSN two في النواة. ومن المهم أنه يمكن تحليل المسار الزمني لمستويات MSN two YFP النووية في الخلايا المفردة. وبذلك، يمكن استخدام جهاز PDMS للموائع الدقيقة لتطبيق ظروف ديناميكية متزامنة على آبار متعددة.عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم ترك الخلايا تجف أثناء تجميع الجهاز. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بسهولة دون الحاجة إلى الليثوغرافيا الناعمة.

a-microfluidic-device-for-studying-multiple-distinct-strains

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

وصفنا بروتوكول لتصنيع أجهزة ميكروفلويديك التي تتيح التقاط الخلايا والثقافة. في هذا النهج تستخدم المجهرية منقوشة مثل الأخاديد داخل قنوات ميكروفلويديك لإنشاء مناطق منخفضة إجهاد القص داخل الخلية والتي يمكنها ان ترسو.

جهاز ميكروفلويديك مع أنماط Groove لدراسة السلوك الخليوي

يصف هذا البروتوكول على تطوير جهاز للتحقيق في ميكروفلويديك الكيميائي الجرثومي في التدرجات تركيز chemoeffectors مستقرة.

جهاز ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس تركيز البكتيريا في التدرجات مستقرة

المصدر: كابين، م. ت. وآخرون. تحليل الميكروفلويد أحادي الخلية لباسيلوس سبتيليس. J. Vis. Exp. (2018)يوضح الفيديو استخدام جهاز ميكروفلويديك لمراقبة نمو البكتيريا على مستوى الخلية الواحدة. يعرض كيف يتم تغذية الخلايا البكتيرية غير المتحركة، المحصورة داخل خنادق على نطاق دقيق، بشكل مستمر وتصويرها تحت مجهر فلوري. يتيح هذا الإعداد التصور الفوري لتتبع انقسام الخلايا وتتبع النسب عبر أجيال متعددة.

تتبع نمو البكتيريا بدقة خلية واحدة في نظام ميكروفلويديك

في هذا البروتوكول ، يتم تقديم تصنيع وإعداد وتشغيل أساسي لمفاعل حيوي بيكوليتر ميكروسويديك (PLBR) لتحليل الخلية المفردة للكائنات الحية الدقيقة بدائية النواة. تم تحليل الكائنات الحية الدقيقة ذات الصلة صناعيا كدليل على المبدأ مما يسمح برؤى حول معدل النمو والتشكل وعدم تجانس النمط الظاهري خلال فترات زمنية معينة ، وهو أمر يصعب تحقيقه بالطرق التقليدية.

المفاعل الحيوي Picoliter Microfluidic لتحليل الخلية الميكروبية أحادية الخلية: التصنيع وإعداد النظام والتشغيل

في هذه المقالة نقدم رقاقة ميكروفلويديك لتحليل خلية واحدة. أنه يسمح للالكمي للبروتينات الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة، ورسله الثاني عن طريق فحوصات الفلورسنت أو المناعية.

رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل الخلايا المفردة واستزراعها باستخدام منصة ميكروفيليديك ، والتي تستخدم مفهوما جديدا لتصميم microwell للسماح بعزل الخلية المفردة عالي الكفاءة والثقافة النسيلة طويلة الأمد.

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

نحن نقدم طريقة لتحليل موائع جزيئية الأنساب الخلية البكتيرية الفردية باستخدام نجحت عصية على سبيل مثال. الأسلوب ويتغلب على أوجه قصور أساليب التحليلية التقليدية في علم الأحياء الدقيقة بالسماح بمراقبة مئات الأجيال الخلية تحت ظروف النمو يمكن السيطرة عليها بشكل محكم وموحدة.

تحليل موائع جزيئية خلية واحدة نجحت عصية

يصف هذا التقرير أسلوبا قائما علي الرقاقات الصغيرة لاعداد تجربه ثقافة خليه واحده يمكن فيها تحقيق الاقتران العالي الكفاءة والتحليل المجهري للخلايا المفردة المتعددة.

إنشاء الثقافات المشتركة القائمة علي خليه واحده بطريقه قطعيه مع رقاقه ميكروفلويدريك

نحن نقدم نظام microfluidic لدراسات الإنتاجية العالية على آلات الحياة المعقدة ، والتي تتكون من 1500 وحدة ثقافة ، ومجموعة من المضخات التجهر المحسنة ومعامل خلط في الموقع. رقاقة microfluidic يسمح لتحليل الظروف البيئية الدقيقة معقدة للغاية وديناميكية في الجسم الحي.

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

نظرا لعتامة التربة ، لا يمكن بسهولة تصور التفاعلات بين الميكروبات المكونة لها بدقة خلوية. هنا ، يتم تقديم أداتين للسوائل الدقيقة ، والتي توفر فرصا جديدة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية. الأجهزة متعددة الاستخدامات وسهلة الاستخدام ، مما يتيح التحكم الزماني المكاني العالي والتصوير عالي الدقة على المستوى الخلوي.

أدوات الموائع الدقيقة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية على المستوى الخلوي

نقدم بروتوكولا لجهاز الزراعة المستمر الميلي فلويديك (MCCD)، الذي يسمح بزراعة تجمعات البكتيريا في ظروف منخفضة المغذيات باستمرار (حتى مئات التركيزات النانومولية) أو تقلبات المغذيات الزمنية على نطاق زمني دقيق.

جهاز ميلي فلويديك مزرعة مستمرة لدراسة الإشريكية القولونية تحت ظروف منخفضة ومتقلبة من العناصر الغذائية

استكشف تصوير سلوك الخلايا الفردية من سلالات الخمائر المختلفة باستخدام جهاز ميكروفلويديك ثنائي الطبقات. يتيح هذا الأسلوب دراسة الاستجابات الديناميكية دون تلوث متبادل بين الآبار.

جهاز ميكروفلويديك لدراسة سلالات متميزة متعددة

استكشف المزيد من الفيديوهات