جهاز ميكروفلويديك لدراسة سلالات متميزة متعددة
November 9th, 2012
نقدم طريقة بسيطة لإنتاج أجهزة ميكروفلويديك قادرة على تطبيق شروط دينامية مماثلة لسلالات متميزة متعددة، دون الحاجة إلى غرفة نظيفة أو الطباعة الحجرية الناعمة.
الهدف العام من الطريقة التالية هو تصوير سلوك الخلايا المفردة من سلالات مختلفة من الخميرة في ظل نفس الظروف الديناميكية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع جهاز ميكروفلويديك من طبقتين ، أو ستحتوي الطبقة السفلية على كل من السلالات المختلفة على حدة ، وستوفر الطبقة العليا ظروف التدفق الديناميكي كخطوة ثانية. يتم وضع سلالات خميرة مختلفة في الآبار ويتم إغلاق الجهاز ، مما يخلق قناة واحدة ذات سلالات منفصلة متعددة.
بعد ذلك ، نقوم بتصوير استجابات الخلية لتغيرات الوسط الديناميكي من خلال التحكم في معدلات التدفق في مدخلي القناة Y ، تظهر النتائج سلالات مختلفة معرضة لنفس الظروف الديناميكية وعدم وجود تلوث متبادل بين الآبار. يتميز جهاز الموائع الدقيقة هذا بالعديد من المزايا الرئيسية مقارنة بالأنظمة الأخرى الموجودة. يسمح بتصوير سلالات متميزة متعددة في ظل نفس الظروف الديناميكية.
أيضا ، الأهم من ذلك ، يمكن تصنيعها بسهولة في أي مختبر دون الحاجة إلى معدات خاصة. جاءت هذه الطريقة من مناقشة حول كيفية متابعة استجابات عزلات الشرق البري المختلفة لتمريرات الجوع. ابدأ تخطيط القناة الدقيقة المطلوب أو ارسم أو اطبعه لتوسيع نطاقه.
بعد ذلك ، قم بتغطية شريحة زجاجية بطبقات من الشريط اللاصق لتحقيق الارتفاع المطلوب للقناة ، ضع تصميم التخطيط على سطح مستو وقم بمحاذاة الشريحة فوق نمط التصميم. الآن قم بقص الشريط بعناية على الشريحة الزجاجية وفقا للتخطيط. قم بإزالة الشريط اللاصق من جميع مناطق الشريحة الزجاجية.
اقبل تلك الموجودة في تخطيط القناة الصغيرة. ضع الشريحة في فرن تسخين 65 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم نظف برفق باستخدام الإيثانول.
امزج مكونات القاعدة والمعالجة من PDMS على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. صب حوالي 30 مل من خليط PDMS في طبق بتري على ارتفاع حوالي 0.5 سم. قم بإزالة PDMS في الفراغ إذا لزم الأمر.
اغمر الشريحة الزجاجية في نظام PDMS بحيث يكون الشريط اللاصق المزخرف متجها لأعلى. يمنع وضع النمط بعد PDMS تكوين فقاعات الهواء بين الشريحة والطبق علاج القاع لمدة 48 ساعة عند 65 درجة مئوية ، مع التأكد من أن الطبق أفقي باستخدام مستوى فقاعة في طبق بتري جديد مقاس 90 ملم. صب ثلاثة ملليلتر من مزيج PDMS.
يمكن تنفيذ هذه الخطوة على مبرمج الدوران إذا كان ذلك متاحا. DGAs والعلاج كما هو موضح سابقا. الآن قم بقص طبقة التدفق لجهاز الموائع الدقيقة برفق إلى الحجم المطلوب باستخدام أداة ثقب الخزعة.
قم بإنشاء ثقوب للمداخل والمنافذ في طبقة التدفق. اقطع أيضا طبقة آبار متشابهة الحجم من طبق بتري الثاني وضعها على كوب سميك. مرر فوق تخطيط التصميم.
ثم قم بإخراج الآبار بمحاذاة مع القنوات الدقيقة على التصميم باستخدام الإيثانول ، وقم بتنظيف كل من طبقات PDMS وانزلاق الغطاء الزجاجي وجففه في الهواء. بعد ذلك ، عالج انزلاق الغطاء الزجاجي وطبقة الآبار PDMS إما بحفر البلازما القياسي للترابط غير القابل للانعكاس أو معالج الهالة المحمول للربط القابل للانعكاس. ضع طبقة الآبار بحذر أعلى زلة الغطاء لإحداث التصاق.
فرك أي فقاعات هواء برفق. قم بإعداد الوسائط المطلوبة في المحاقن المناسبة وتوصيلها بأنابيب tigon الملولبة من خلال مضخة حقنة. لتصوير الخلايا.
استخدم نقاط القوة. انتقل إلى المرحلة المطلوبة ، وقم بتدوير الثقافة بدقة ، ونقل 300 ميكرولتر إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة. ضع ميكرولتر واحد من con canna A برفق في كل بئر من طبقة آبار PDMS.
اغسل الكونا أ الزائدة من كل بئر مرتين عن طريق سحب الماء برفق أثناء تجفيف الخداع الموجود في A. اغسل السلالات مرتين ب 300 ميكرولتر من وسط SC الذي يفتقر إلى الجلوكوز. يساعد غسل الجلوكوز المتبقي من جدران الخلايا على الالتزام السليم بالصلاحية.
في ما بعد الدوامة ، تقوم الخلايا بعمل ماصة كاملة حوالي 0.5 ميكرولتر من تعليق الخلية في الآبار الفردية. اغسل الخلايا المتبقية برفق بوسط غني. يجب تنفيذ الخطوتين التاليتين بسرعة لمنع الخلايا من الجفاف.
كخطوة اختيارية للبلازما ، عالج الرقاقة والآبار مع الحرص على عدم ضرب الآبار مباشرة. ثم تحت مجسم ، ضع الرقاقة بعناية على الآبار مع إيلاء اهتمام وثيق للمحاذاة بين الاثنين. اضغط برفق للالتصاق بطبقتين من PDMS.
املأ الجهاز ببطء بالكامل بحوالي 50 ميكرولترا من الوسط الغني ، مع التأكد من عدم ترك فقاعات هواء داخل القناة. الآن قم بتوصيل الجهاز الذي يقوم بإدخال الأنابيب في المداخل المناسبة وبدء تدفق الوسائط. احرص على عدم تشكل فقاعات هواء في الأنبوب حيث يمكن أن تعلق في الجهاز وتدمر التدفق.
تابع وضع الجهاز تحت المجهر وابحث عن نقاط التصوير المناسبة في كل منها. حسنا ، حافظ على الخلايا تحت تدفق غني ومتوسط لمدة ساعة واحدة أو أكثر إذا لزم الأمر. للسماح بالتعافي.
ابدأ التجربة بإعداد التدفق المستمر. المضخة A إلى 0.8 مل في الساعة والمضخة B إلى 0.2 مل في الساعة. بالنسبة للمتوسط يتدفق أكثر من 80٪ من عرض القناة.
يمكننا تغيير الظروف في الجهاز ديناميكيا عن طريق تغيير معدلات التدفق النسبية. تستقر الظروف الجديدة في غضون ثوان على طول القناة بأكملها لإثبات الفصل بين السلالات المختلفة. يتم تصوير سلالتين مميزة من الخميرة في آبار بديلة.
لاحظ أنه لا يوجد تسرب خلوي بين الآبار في هذه التجربة. تحتوي كلتا السلالتين على عامل النسخ MSN الثاني الموسوم ب YFP لاختبار التأثير المتزامن للظروف المتغيرة ديناميكيا. تم تغيير معدلات التدفق في قناتي الإدخال لإنشاء خطوة بدون وسط جلوكوز.
أدى ذلك إلى توطين MSN اثنين إلى النواة. الأهم من ذلك ، يمكن تحليل المسار الزمني ل MSN النووي مستويين من YFP في خلايا مفردة. لذلك يمكن استخدام جهاز الموائع الدقيقة PDMS لتطبيق الظروف الديناميكية المتزامنة على آبار متعددة.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم ترك الخلايا تجف أثناء تجميع الجهاز. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بها بسهولة دون الحاجة إلى الطباعة الحجرية الناعمة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لتصوير سلوك خلايا الخميرة الفردية من سلالات مختلفة تحت ظروف ديناميكية متطابقة باستخدام جهاز دقيق الجريان. تم تصميم الجهاز لمنع التلوث المتبادل مع السماح بمراقبة عدة سلالات في وقت واحد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الجريان الدقيق
- تصوير الخلايا
- بيولوجيا الخميرة
الخلفية
- فهم سلوك الخلية في ظل الظروف الديناميكية أمر بالغ الأهمية للعديد من الدراسات البيولوجية.
- غالبًا ما تتطلب الطرق التقليدية بيئات غرف نظيفة وتقنيات تصنيع معقدة.
- تهدف هذه الدراسة إلى تبسيط العملية مع الحفاظ على سلامة التجربة.
- توفر أجهزة الجريان الدقيق تحكمًا دقيقًا في الظروف البيئية لدراسات الخلايا.
هدف الدراسة
- تطوير جهاز دقيق الجريان يسمح بتصوير عدة سلالات من الخميرة في وقت واحد.
- تطبيق ظروف تدفق ديناميكية على سلالات مختلفة دون تلوث متبادل.
- تعزيز فهم استجابات خلايا الخميرة للتغيرات البيئية.
الطرق المستخدمة
- تصنيع جهاز دقيق الجريان مكون من طبقتين.
- وضع سلالات مختلفة من الخميرة في آبار منفصلة للجهاز.
- تطبيق ظروف تدفق ديناميكية من خلال معدلات تدفق محكومة.
- تصوير استجابات الخلايا للتغيرات في الوسط.
النتائج الرئيسية
- نجح الجهاز في الحفاظ على الفصل بين سلالات الخميرة المختلفة.
- كشف التصوير عن استجابات مختلفة للسلالات الخميرة لنفس الظروف الديناميكية.
- أظهرت الطريقة مزايا على الأنظمة الحالية من حيث البساطة والفعالية.
- لم يتم ملاحظة أي تلوث متبادل بين الآبار أثناء التجارب.
الاستنتاجات
- يوفر هذا الجهاز الدقيق الجريان نهجًا جديدًا لدراسة عدة سلالات من الخميرة.
- تسمح الطريقة بالتجربة المحكومة دون الحاجة إلى إعدادات معقدة.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية لتشمل أنواع خلايا أخرى وظروف تجريبية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Comparative analysis of multiple cell strains under identical dynamic conditions is critical for early discovery and target validation in biopharma R&D. This microfluidic device enables simultaneous, contamination-free imaging of distinct yeast strains, supporting robust hypothesis testing and mechanistic de-risking. Its accessible fabrication and dynamic control streamline workflows at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of cellular responses across multiple strains under controlled environmental shifts.
- Supports functional target validation by isolating strain-specific phenotypes in a shared dynamic context.
- Facilitates mechanistic de-risking by eliminating environmental variability as a confounder.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, contamination-free biological systems for downstream quantitative assays.
- Standardizes environmental exposure, enhancing reproducibility and assay reliability.
- Enables high-content imaging and multiplexed readouts for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns experimental conditions for translational biomarker discovery when using disease-relevant yeast models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent dynamic perturbations.
- Reduces risk of false positives by ensuring environmental uniformity across strains.
Pipeline & Workflow Integration
This device integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling parallel, quantitative analysis of multiple strains under synchronized dynamic conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by controlling environmental variables across strains.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic continuity when relevant to yeast-based disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, easily manufactured platform adaptable to diverse strain panels and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in comparative studies.
- Operational Value: Simplifies device fabrication and standardizes experimental setup across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enabling direct, quantitative strain comparisons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying strain-specific responses under uniform conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic assembly and quantitative cell imaging.
- Needs access to basic PDMS fabrication tools and standard microscopy infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of environmental flow parameters.
- Adaptable to other model systems with similar size and adherence properties.
- Practical limitations include throughput constraints and manual alignment steps.
