المفاعل الحيوي Picoliter Microfluidic لتحليل الخلية الميكروبية أحادية الخلية: التصنيع وإعداد النظام والتشغيل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل البكتيريا المفردة والمستعمرات الدقيقة المتساوية التطور بدقة مكانية وزمانية كاملة في ظل ظروف بيئية ثابتة باستخدام جهاز زراعة الموائع الدقيقة. يتم تحقيق ذلك من خلال تصميم نظام زراعة الموائع الدقيقة أولا باستخدام برنامج CAD. بعد ذلك ، يتم تصنيع أجهزة زراعة الموائع الدقيقة التي تستخدم لمرة واحدة من بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان التي تحتوي على مفاعلات حيوية بيكوليتر ، ميكرون واحد وارتفاع لتقييد نمو البكتيريا أحادية الطبقة.

ثم يتم غرس الثقافة الميكروبية في جهاز الموائع الدقيقة لتلقيح الخلايا الأم الوحيدة داخل المفاعلات الحيوية. يتم توسيع هذه الخلايا عن طريق التسريب المستمر لوسط النمو من خلال النظام. يتم الحصول على النتائج من الفحص المجهري الآلي بفاصل زمني يوضح زراعة سلالة ذات صلة صناعيا من Corynebacterium glutamicum ، وبيانات النمو ، وعدم تجانس الخلية الخلوية.

في التكنولوجيا الحيوية التقليدية ، تستند معظم التحليلات إلى متوسط البيانات. يسهل جهاز الموائع الدقيقة الخاص بنا تحليل الخلية المفردة للبكتيريا الفردية بدقة مكانية وزمانية. إنها أداة مفيدة للنظر عن كثب في عدم تجانس الخلية إلى الخلية للمستعمرات الدقيقة متساوية الجين.

نحن نطبق الطباعة الحجرية الضوئية الشائعة SU-8 وقولبة رقاقة بولي ديميثيل سيلوكسان لتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة ذات الاستخدام الواحد بدقة الوسائط الدقيقة الفرعية. لقد أظهرنا بنجاح تقنيتنا مع العديد من الكائنات الحية الدقيقة التقنية الحيوية مثل الإشريكية القولونية والكورينيباكتيريوم الجلوتاميكوم. للبدء ، قم بتصميم جهاز الموائع الدقيقة باستخدام برنامج CAD.

يتكون التصميم المقدم في هذا البروتوكول من مدخلين للبذر ، ومولد متدرج لخلط ركيزتين مختلفتين ، ومخرج واحد ، وستة مصفوفات تتكون من خمسة مفاعلات حيوية لكل منهما. في غرفة نظيفة ، قم بإعداد رقاقة سيليكون بحجم أربعة بوصات وقم بتدوير كود ميكرون واحد من SU-8 2000.5 مقاوم للضوء على الرقاقة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. ضع الرقاقة المطلية على لوح ساخن عند 95 درجة مئوية لطرد المذيبات الزائدة ، ثم أدخل قناع صور الطبقة الأولى الذي يتكون من مناطق الاصطياد لمفاعلات البيكوليتر والرقاقة المطلية داخل محاذاة القناع.

بعد ذلك ، قم بتعريض الرقاقة في وضع التلامس الفراغي لضوء 350 إلى 400 نانومتر لمدة ثلاث ثوان بكثافة سبعة مللي واط لكل سنتيمتر مربع. قم بإجراء خبز بعد التعرض على صفيحة ساخنة مستوية عند 95 درجة مئوية لبدء بلمرة SU-8. بعد ذلك ، ضع الرقاقة في حمام مطور SU-8 لمدة دقيقة واحدة ، ثم انقل الرقاقة إلى حاوية ثانية مع مطور SU-8 جديد لبضع ثوان.

اشطف الرقاقة في الأيزوبروبانول لإزالة مطور SU-8 وتجفيف الرقاقة باستخدام تدفق النيتروجين أو دوار الرقاقة. ثم اخبزي الرقاقة لمدة 10 دقائق على حرارة 150 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتصنيع الطبقة الثانية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب لإكمال القالب الرئيسي.

ابدأ تصنيع رقاقة PDMS عن طريق خلط القاعدة وعامل الحمل بنسبة 10 إلى واحد. قم بإزالة خليط PDMS لمدة 30 دقيقة تقريبا داخل مجفف مفرغ حتى تختفي جميع الفقاعات. بعد ذلك ، ضع رقاقة SU-8 في جهاز التشكيل واسكب طبقة من ثلاثة ملليمترات من خليط PDMS على الرقاقة.

ثم اخبزي PDMS لمدة ثلاث ساعات عند 80 درجة مئوية في فرن. بمجرد أن يبرد ، قشر لوح PDMS بعناية من الرقاقة وقم بتقطيع البلاطة إلى رقائق مفردة باستخدام مشرط نظيف وحاد. اغسل الرقائق في حمام n-pentane لمدة 90 دقيقة ، متبوعا بحمامين لغسيل الأسيتون لمدة 90 دقيقة لكل منهما.

جفف الرقائق طوال الليل لإزالة أي بقايا مذيبات. قبل التجربة مباشرة ، قم بعمل فتحات المدخل والمخرج في شريحة PDMS باستخدام إبرة أو ثقب بقطر أصغر قليلا من الموصلات المستخدمة لتوصيل الأنابيب بشريحة PDMS. بعد ذلك ، قم بتنظيف شريحة PDMS الموائع الدقيقة بعناية باستخدام الأيزوبروبانول واستخدم شريطا لاصقا لإزالة أي جزيئات غبار ملتصقة.

أيضا ، قم بتنظيف شريحة زجاجية رفيعة 170 ميكرون أولا باستخدام الأسيتون ، ثم الأيزوبروبانول ، متبوعا بالماء منزوع الأيونات ، وجفف الشريحة بتيار من النيتروجين. بمجرد تنظيفها وتجفيفها ، تقوم البلازما بتأكسد الشريحة الزجاجية وشريحة PDMS لمدة 25 ثانية باستخدام قوة 50 واط ومعدل تدفق أكسجين يبلغ 20 سم مكعب. بعد ذلك ، قم بمحاذاة PDMS والشريحة الزجاجية بعناية قبل وضع PDMS على الزجاج ، مما يؤدي إلى التصاق في ثوان.

قم بتأمين الرابطة عن طريق خبز الإعداد لمدة 10 ثوان عند 80 درجة مئوية. لتحضير البكتيريا لتجربة الرقائق ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من السلالة البكتيرية المرغوبة ، مثل C.glutamicum في 20 مل من وسط BHI الطازج ، واحتضان الثقافة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية على شاكر دوار عند 120 دورة في الدقيقة. في صباح اليوم التالي ، انقل 10 ميكرولتر من ثقافة البادئ إلى مزرعة ثانية تحتوي على 20 مل من الوسط المطلوب واترك الخلايا تنمو طوال الليل في ظل نفس الظروف.

في اليوم التالي ، قم بتسخين حاضنة المجهر المقلوب مسبقا إلى 30 درجة مئوية. قد يستغرق ذلك ما يصل إلى ساعتين حسب الإعداد الفردي. أثناء ارتفاع درجة حرارة الإعداد ، افتح الحاضنة وحدد الهدف المطلوب وقم بإعداده بأي وسيط تركيب مطلوب.

بعد ذلك ، قم بتركيب الشريحة داخل حامل الشريحة وثبتها في مكانها. قم بتوسيط العينة على المجهر والتركيز على مصفوفات المفاعل الحيوي picoliter. مع التركيز على الشريحة ، قم بتوصيل المداخل والمنافذ بالأنابيب المناسبة ثم ضع أنبوب المخرج في خزان النفايات.

بعد ذلك ، املأ حقنة بوسائط جديدة ، وضعها في مضخة حقنة ، واشطف قنوات الموائع الدقيقة لمدة ساعة واحدة بمعدل تدفق 200 نانولتر في الدقيقة لتجهيز الشريحة. بينما لا تزال الخلايا في مرحلة النمو الأسي المبكرة ، انقل ملليلترا واحدا من الثقافة البكتيرية إلى حقنة معقمة واستبدل المحقنة والأنابيب المحتوية على الوسائط بتعليق الخلية والأنابيب الجديدة. قم بغرس تعليق الخلية في القنوات بمعدل تدفق حجمي يبلغ 200 نانولتر في الدقيقة حتى تمتلئ معظم المفاعلات الحيوية للبيكوليتر.

إذا تم ملء عدد صغير فقط من المفاعلات الحيوية ، فقم بزيادة معدل التدفق إلى 800 إلى 1200 نانولتر في الدقيقة. عندما يتم زرع الكمية المطلوبة من الخلايا ، افصل معلق الخلية ، وأعد توصيل وسط النمو بالشريحة ، وقم بتسخينه بوسائط جديدة بسرعة 100 نانولتر في الدقيقة. بعد ذلك ، امسح الشريحة وحدد مفاعلات حيوية محددة للتصوير بفاصل زمني.

بعد ذلك ، قم بتكوين تسلسل مجهري بفاصل زمني من أجل تصوير المفاعلات الحيوية من البداية إلى النهاية وبدء التجربة. بمجرد أن تتضخم جميع المفاعلات الحيوية للبيكوليتر ، أوقف التجربة وتخلص من الرقائق بشكل مناسب. لبدء التحليل ، أولا ، حدد المفاعلات الحيوية التي تفي بجميع المعايير المطلوبة للتجربة مثل عدد الخلايا الأم وموضعها.

باستخدام برنامج تحليل ، مثل الصورة J ، حدد معدل نمو كل مستعمرة دقيقة عن طريق حساب عدد الخلايا في كل نقطة زمنية. احسب الحد الأقصى لمعدل النمو عن طريق رسم الوقت مقابل سجل رقم الخلية. يمكن تطبيق النظام المقدم هنا لدراسة الأنواع البكتيرية المختلفة فيما يتعلق بالمعلمات البيولوجية المختلفة مثل النمو أو التشكل أو إشارة الفلورسنت.

في هذا المثال ، تم استزراع C.glutamicum في ظل ظروف الزراعة القياسية ويتم عرض منحنيات النمو الناتجة المشتقة من ثلاث مستعمرات دقيقة متساوية التكوين هنا. أثبتت المفاعلات الحيوية Picolier أيضا فائدتها في الوصول إلى إنتاج البروتين من خلال استخدام الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني كما هو موضح هنا. من خلال تعريض الخلايا لتركيز منخفض من محفز البروتين IPTG ، يمكن دراسة الاختلافات الخلية للخلية للبروتين على مستوى الخلية المفردة داخل المستعمرات بدءا من خلية أم واحدة.

يمكن تطبيق التقنية الموضحة لمراقبة وتحليل الخلايا البكتيرية المفردة مع التحكم البيئي المثالي. هذا بالكاد ممكن باستخدام أنظمة الزراعة التقليدية على نطاق المقعد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير رقائق زراعة الموائع الدقيقة لإجراء تحليل خلية واحدة مماثل.