تقنية ميكروفلويديك للتحقيق التشوه خلية

الهدف العام من التجربة التالية هو التحقيق في قدرة التشوه لأنواع الخلايا المختلفة باستخدام اختبار بسيط قائم على الموائع الدقيقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع جهاز بولي ثنائي ميثيل سوبوكسان أو PDMS microfluidic لاستكشاف المقياس الزمني لعبور الخلية من خلال سلسلة من الانقباضات على نطاق الميكرون ، ثم يتم استخدام التدفق المدفوع بالضغط لدفع الخلايا عبر قنواتها الموائع الدقيقة ، مما يتيح فحص التشوه والاسترخاء المعتمد على الوقت للخلايا الفردية. بعد ذلك ، يتم تشغيل برنامج تحليل الصور الآلي من أجل معالجة مقاطع الفيديو والحصول على رسم بياني لبيانات وقت العبور.

تظهر النتائج أن أنواعا مختلفة من الخلايا تظهر اختلافات في قدرة تشوه الخلايا بناء على وقت عبورها من خلال سلسلة من الانقباضات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية مثل الفحص المجهري للقوة الذرية أو شفط الماصة الدقيقة هي أن أجهزة الموائع الدقيقة يمكن أن تعمل بنجاح بقدرات إنتاجية عالية. بينما يمكن أيضا استخدام أجهزة الموائع الدقيقة الأخرى لفحص الخلية de قابلية التشكيل.

نصمم أجهزتنا بحيث تمر الخلايا عبر انقباضات متسلسلة ، وهي هندسة شائعة في السياقات الفسيولوجية مثل السرير الشعري الرئوي. للبدء ، قم بتصميم جهاز الموائع الدقيقة عن طريق تحديد عرض قنوات مصفوفة الانقباض ليكون حوالي 30 إلى 50٪ من متوسط قطر الخلية وارتفاع القناة ليكون 50٪ على الأقل من قطر الخلية. قم بتضمين عامل تصفية في منافذ الإدخال لإزالة الحطام وتصنيف مجموعات الخلايا.

قبل البدء في التجربة ، قم بتصنيع الجهاز الرئيسي باستخدام التقنيات القياسية للتصنيع الدقيق للطباعة الحجرية. تحقق من ارتفاع ميزات النمط باستخدام مقياس التنظير. بعد ذلك ، قم بإصلاح مصدر الهواء للتدفق المدفوع بالضغط باستخدام خزان من الهواء المضغوط وسلسلة من منظمات الهواء والتجهيزات.

قم أولا بإعداد خزان إمداد الهواء ومنظم يدوي. ثم قم بإعداد منظم ضغط يتم التحكم فيه إلكترونيا بما يتماشى مع المنظم اليدوي. استخدم الكود البسيط المكتوب في LabVIEW لإدخال الضغط المطلوب.

المحول الكهربائي الهوائي حلقة تغذية مرتدة داخلية لضبط ضغط مخرج الصمام ليتناسب مع الضغط المحدد عبر جهاز الموائع الدقيقة. قم بإعداد غرفة مضغوطة لدفع تدفق تعليق الخلية عن طريق تجميع غرفة تعليق الخلية من أنبوب مقياس التدفق الخلوي القياسي وغطاء آلي يخلق ختما محكما للضغط على الأنبوب. يحتوي غطاء غرفة الضغط على فتحتين ، مدخل يتصل بخزان الهواء المضغوط ومخرج تتدفق من خلاله الخلايا من الغرفة المضغوطة إلى الجهاز.

بعد ذلك ، قم بإعداد مجهر مقلوب مزود بكاميرا بمعدل اكتساب لا يقل عن 100 إطار في الثانية. لالتقاط صور للخلايا المتدفقة عبر مجموعة الانقباض ، قم بإعداد محلول خافض للتوتر السطحي في محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS لأن إضافة كمية صغيرة من الفاعل بالسطح إلى محلول وسائط الخلية سيساعد على تقليل التصاق الخلية بجدران PDMS. لتصنيع كتلة PDMS بقنوات الموائع الدقيقة ، أضف جراما واحدا من عامل المعالجة إلى 10 جرامات من قاعدة PDMS واخلطها جيدا.

صب الخليط فوق الجهاز. إتقان ديغا في جرة جرس مع فراغ مطبق حتى تختفي الفقاعات المحاصرة ، أو لمدة 10 إلى 20 دقيقة. بعد هذا الوقت ، قد لا تزال هناك فقاعات في واجهة AIR PDMS ، وهو أمر طبيعي.

عادة ما تتبدد هذه أثناء الخبز. ثم اخبز جهاز Degas على حرارة 65 درجة مئوية لمدة أربع ساعات بعد أن يبرد الجهاز. قم بإزالة أجهزة الموائع الدقيقة من القالب الرئيسي.

ابدأ برفع أحد أركان الجهاز برفق. تقشير بطيء ولطيف بدلا من الرفع تقلل كتلة PD DMS بشكل مستقيم من الضغط على كل من PDMS والرئيسية قم بقص الأجهزة الموائع الدقيقة الفردية من كتلة PDMS بشفرة حلاقة وإزالة الجهاز من ثقب الثقوب الرئيسية في جهاز PDMS لإنشاء منافذ توصيل للوصول بين الأنابيب والقنوات الدقيقة. قم بإنشاء ثقوب من جانب القناة إلى الجانب الخارجي للجهاز باستخدام ثقب الخزعة.

اشطف جهاز PDMS بالأيزوبروبانول لإزالة الغبار ووضع قطع من PDMS. تأكد من أن الثقوب المثقوبة خالية من الحطام عن طريق توجيه تيار مستمر من الأيزوبروبانول النقي من زجاجة ضغط عبر الثقوب. جفف بالهواء المصفى.

نظف الركيزة الزجاجية عن طريق الشطف بالميثانول. ثم جففها بالهواء المصفى وضعها على لوح ساخن 200 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق للتأكد من أن الزجاج نظيف وجاف تماما قبل معالجة البلازما. كما هو مفصل في بروتوكول النص ، افحص جهاز الموائع الدقيقة تحت المجهر.

تأكد من عدم طي القنوات أو كسرها ، وأن فتحات المدخل والمخرج متصلة مباشرة بقنوات الجهاز باستخدام هدف منخفض الطاقة. ضع تعليق الخلية في أنبوب مقياس التدفق الخلوي وقم بتوصيله بغطاء الضغط قبل توصيل الأنبوب بجهاز الموائع الدقيقة ، واضبط الضغط على حوالي 14 إلى 21 كيلو باسكال وقم بشطفه حتى يخرج تعليق الخلية من طرف الأنبوب. بعد ذلك ، ضع الجهاز على سطح مستو لإدخال الأنبوب في مدخل الجهاز.

نظرا لأن انزلاق الغطاء الزجاجي المرتبط بالجانب السفلي من جهاز PDMS هش. أدخل طرف الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية في مدخل الجهاز. ثم أدخل قطعة من الأنابيب في منفذ الخروج وقم بتوجيهها إلى أنبوب فارغ لجمع النفايات ، مثل أنبوب فالكون الفارغ الملصق على جانب مرحلة المجهر.

بتكثيف الضغط برفق إلى حوالي 28 كيلو باسكال أو حتى تتدفق الخلايا عبر القنوات. ضع الجهاز بحيث تكون قنوات متعددة في مجال الرؤية وتكون متعامدة مع أسفل الشاشة. لبدء تحليل البيانات ، افتح ملف البرنامج النصي الرئيسي m وقم بتشغيل البرنامج.

حدد الفيديو الأول الذي سيتم تحليله من نافذة مستكشف Windows التي تظهر. حدد معدل الإطارات للفيديو المحدد واضغط على Enter. سيظهر شكل يطالب المستخدم بتحديد نافذة اقتصاص مستطيلة.

بالنسبة للفيديو الأول ، حدد نافذة تشمل جميع القنوات من اليسار إلى اليمين وتتقاطع مع القنوات فوق المصباح الأول مباشرة من مصفوفة القنوات. في أعلى وأسفل ، حدد مناطق الانقباض من الصورة التي تم اقتصاصها. تعرض الخوارزمية تجزئة الخلايا لأول 50 إطارا من كل مقطع فيديو.

راقب الصورة العلوية اليسرى عن كثب لتحديد ما إذا كانت الخوارزمية تحدد موقع الخلايا بدقة. يتم تثبيت صورة مجزأة على الفيديو المصدر. لتوضيح موقع الخلايا المحددة، حدد الفيديو التالي المراد معالجته من نافذة مستكشف Windows.

ستتكرر الخوارزمية. لكل فيديو محدد، اختر إلغاء. بمجرد إضافة جميع مقاطع الفيديو المطلوبة عبر نافذة مستكشف Windows لإرشاد الوظيفة التي تكون قائمة الفيديو كاملة ، تظهر النتائج التمثيلية لوقت عبور HL 60 ونوع HL 60 من نوع HL 60 المقياس الزمني لخلية واحدة للعبور عبر سلسلة من القيود التي يتم نقلها.

يتم قياس الوقت لمجموعة من الخلايا الفردية عند كل انقباض سبعة ميكرومتر في سلسلة من سبعة انقباضات. عند ضغط قيادة يبلغ 28 كيلو باسكال HL ، تقوم خلايا 60 بإغلاق الانقباض الأول مؤقتا لمدة متوسط 9.3 مللي ثانية قبل التعبئة من خلال الانقباضات اللاحقة. على النقيض من ذلك ، فإن خلايا HL 60 من نوع العدلات تحجب الانقباض الأول لمدة 4.3 مللي ثانية فقط قبل التعبئة.

بمجرد المرور عبر الخلايا الانقباضية الأولى ، تنتقل بسرعة أكبر عبر الانقباضات المتبقية من اثنين إلى سبعة ، مع متوسط وقت عبور يبلغ 4.0 مللي ثانية لخلايا HL 60 و 3.3 مللي ثانية للخلايا من نوع العدلات. من خلال مقارنة وقت العبور بين مجموعات الخلايا ، يمكن الكشف عن الاختلافات في الخلية de عدم الخبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس قدرة التشوه لأنواع الخلايا المختلفة باستخدام مقايسة الموائع الدقيقة البسيطة.

هنا ، يتم استخدام التدفق المدفوع بالضغط لدفع الخلايا عبر قنوات الموائع الدقيقة ، مما يتيح تشوه واسترخاء الخلايا الفردية ليكون فحصا.