مضادات الميكروبات توصيف المواد المتقدمة لتطبيقات الهندسة الحيوية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة المواد ، مثل الخصائص المضادة للميكروبات ، والتي تعتبر مرغوبة جدا للعديد من تطبيقات الهندسة الحيوية. يمكن استخدام هذه التقنية كبروتوكول متسق عبر المختبرات لمساعدة الباحثين الأقل خبرة الذين يحتاجون إلى إجراءات متعمقة خطوة بخطوة لاتباعها للحصول على نتائج دقيقة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في البحث عن بروتوكولات مضادة للميكروبات ، وأدركنا أنه لا توجد بروتوكولات مفصلة حول هذا البروتوكول في الأدبيات.

في هذه الدراسة ، سيتم اختبار أربع مواد متقدمة ذات طبيعة كيميائية مختلفة ومواد تحكم للنشاط المضاد للميكروبات. قم بإعداد كل مادة عن طريق تقطيعها إلى أقراص قطرها 10 مم. بعد ذلك ، قم بتعقيم كل عينة عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق ، متبوعا بالأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة لكل جانب.

سيتم استخدام ثلاث كائنات دقيقة مختلفة لاختبار النشاط المضاد للميكروبات للمواد المتقدمة. البكتيريا موجبة الجرام ، المكورات العنقودية الذهبية ، البكتيريا سالبة الجرام ، الإشريكية القولونية ، والخميرة ، المبيضات البيض. باستخدام قطعة قطن معقمة ، أعد تعليق عدد قليل من مستعمرات كل كائن حي دقيق في 25 مل من مرق الصويا التريبتيك ، أو TSB ، الموجود في أنبوب طرد مركزي معقم.

دوامة لمدة دقيقة واحدة لتحقيق خلط موحد. قم بقياس الامتصاص عند 540 نانومتر لكل ثقافة للكائنات الحية الدقيقة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. اضبط تركيز كل كائن حي دقيق على عدد مناسب من وحدات تشكيل المستعمرات ، أو CFU لكل مليلتر.

بدوامة التعليق الميكروبي لمدة خمس ثوان لتحسين تشتت الكائنات الحية الدقيقة ، وغمر لفترة وجيزة قطعة قطن معقمة في هذا المعلق الميكروبي. قم بإزالة السائل الزائد من المسحة عن طريق الضغط على المسحة على جدار الأنبوب الذي يحتوي على المزرعة. قم بربط كل معلق مرق ميكروبي بالتساوي باستخدام قطعة قطن معقمة على سطح أجار الصويا التريبتيك ، أو صفيحة TSA ، في ثلاث طائرات لتغطية السطح بالكامل بالكائنات الحية الدقيقة.

دع الأطباق تجف لمدة خمس دقائق بعد التلقيح. اترك معلقات المرق الميكروبي على سطح المقعد لاستخدامها لاحقا للتحقق من تركيز التعليق الميكروبي ونقائه. قم بتعقيم زوج من الملقط عن طريق غمره في دورق يحتوي على 96٪ من الإيثانول ، ثم اشتعال النيران بموقد الكحول.

استخدم الملقط المعقم لوضع أقراص العينة المراد اختبارها في وسط لوحات TSA. احتضان ألواح TSA في وضع مقلوب عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لتحليل نتائج اختبار الانتشار ، قم بقياس قطر منطقة التثبيط وقطر قرص العينة باستخدام الفرجار الرقمي ، أو عن طريق التقاط صورة واستخدام برنامج معالجة الصور المناسب.

هذا الإجراء ضروري للتحقق من صحة التركيزات الميكروبية التي تم تحديدها مسبقا ، وضمان عدم وجود تلوث بيئي ميكروبي. باستخدام ماصة دقيقة ذات أطراف معقمة مناسبة وظروف معقمة ، قم بتوزيع TSB المعقم في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة. قم بتضمين عينة سيتم استخدامها كعنصر تحكم سلبي.

قم بإجراء ستة تخفيفات تسلسلية عشرية باستخدام معلقات المرق الميكروبية المستخدمة سابقا لخطوط لوحات TSA. باستخدام ملعقة Drigalski المعقمة مسبقا ، انشر 100 لتر من كل تخفيف محدد على طبق TSA. انشر 100 لتر من وسط TSB بدون كائنات دقيقة على لوحة TSA كعنصر تحكم سلبي.

احتضان ألواح TSA عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، عد عدد المستعمرات للتحقق من أن CFU لكل مليلتر مشابه لتلك المحددة مسبقا. تحقق من لوحة التحكم السلبية للتأكد من عدم وجود تلوث بيئي ميكروبي.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق زراعة الكائنات الحية الدقيقة المختلفة التي سيتم اختبارها في TSB ، في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بقياس OD540 لكل ثقافة ليلية ، ثم قم بتخفيف كل مزرعة في 20 مل من TSB في أنبوب طرد مركزي معقم مسبقا سعة 50 مل إلى تركيز حوالي عشرة إلى سادس CFU لكل مليلتر. ضع أربعة أقراص من كل نوع من المواد وأربعة أقراص تحكم في آبار منفصلة من صفيحة معقمة 48 بئرا.

الماصة 150 لترا من التعليق الميكروبي على كل سطح قرص. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد تحضين الصفيحة المكونة من 48 بئرا لمدة 24 ساعة ، قم بتعبئة 850 لترا من PBS المعقم على سطح كل قرص من أقراص العينة الأربعة وأربعة أقراص تحكم ، واخلطها مع المعلق الميكروبي.

اجمع كل خليط تعليق ميكروبي PBS وكل قرص من اللوحة المكونة من 48 بئرا ، وانقله إلى أنبوب معقم مسبقا سعة 15 مل. دوامة مخاليط وأقراص التعليق الميكروبي PBS لمدة دقيقة واحدة. صوتنة عند 50 هرتز لمدة خمس دقائق ، والدوامة مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة لضمان عدم بقاء الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة ملتصقة بسطح المادة.

إجراء التخفيفات التسلسلية العشرية للثقافات الصوتية وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة التي تحتوي على TSB. انشر 100 لتر من كل تخفيف على لوحة TSA ، واحتضن الألواح هوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، احسب عدد المستعمرات وعبر عن هذا الرقم في CFU لكل مليلتر.

ثم يتم تحليل نتائج طريقة الاتصال كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر نتائج اختبارات انتشار قرص أجار نشاطا غير مضاد للميكروبات للمادة الأولى ، وزيادة النشاط المضاد للبكتيريا ضد المكورات العنقودية الذهبية والإشريكية القولونية للمواد الثلاث الأخرى. يوضح هذا الرسم البياني الهالة الطبيعية لكل قرص مادة ضد S.aureus و E.coli بعد 24 ساعة من الحضانة.

نتائج طريقة التلامس أيضا إلى نشاط غير مضاد للميكروبات للمادة الأولى ، وزيادة النشاط المضاد للبكتيريا ضد البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام للمواد الثلاث الأخرى. C هي البكتيريا القابلة للحياة التي يتم استردادها من قرص التحكم بعد 24 ساعة من الحضانة. يوضح هذا الرسم البياني النسبة المئوية لفقدان الجدوى للمواد الأربع ضد S.aureus و E.coli على أسطح المواد.

تظهر العينة M1 أي نشاط مضاد للميكروبات. على الرغم من عدم عرضه هنا ، إلا أن أيا من المواد الأربع غير قادرة على منع نمو الخميرة ، المبيضات البيضاء ، بطريقة أخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد النشاط المضاد للميكروبات بهاتين الطريقتين التكميليتين.