تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الفيزيائي الحيوي ، مثل مدى قوة بروتين واحد في تفاعلات البروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لشل حركة مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية المختلفة. بشكل عام ، قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن التعامل مع مسبار ناتئ مجهر القوة الذرية وتشغيل مجهر القوة الذرية نفسه يمكن أن يكون أمرا صعبا.

للبدء ، ارتد قفازات مقاومة للأحماض ونظارات واقية ومعطف مختبر. تحت غطاء الدخان ، استخدم الأيزوبروبانول في مناديل دقيقة خالية من النسالة. قم بإزالة أي غبار خشن وتلوث من عدة شرائح زجاجية.

انقل الشرائح النظيفة إلى برطمان قائم مملوء بحمض الهيدروكلوريك المخفف بالماء المقطر بشكل مضاعف. أغلق البرطمان بغطاء مناسب وضعه في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، انقل مجسات ناتئ نيتريد السيليكون AFM إلى شريحة زجاجية نظيفة بحيث يكون الطرف متجها لأعلى.

انقل الشريحة إلى غرفة غير منفذة للأشعة فوق البنفسجية وقم بإشعاع الشريحة بضوء فوق بنفسجي من الأعلى لمدة 90 دقيقة على الأقل. بعد ذلك ، استبدل حمض الهيدروكلوريك في وعاء التلوين بالماء المقطر بشكل مضاعف ، مع التأكد من عدم ترك سطح الزجاج يجف. أغلق البرطمان بالغطاء وضعه مرة أخرى في الحمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق أخرى.

في هذه الأثناء ، قم بإذابة حمض إيثيوكسي سيلان بولي إيثيلين جلايكول في خليط من الإيثانول والماء المقطر بشكل مضاعف إلى تركيز نهائي يبلغ 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر. أغلق هذا المحلول بإحكام لمنع تبخر الإيثانول. عندما تصبح جاهزا ، اسكب محلول السيلان في طبقين منفصلين من بتري.

ضع الشرائح الزجاجية النظيفة في طبق بتري والكابولي في الآخر. باستخدام البارافيلم ، أغلق كلا اللوحين بإحكام لمنع الإيثانول من التبخر. احتضان الألواح الثابتة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، استخدم ثلاث أكواب متتالية تحتوي على الإيثانول النقي لغسل كل من الكابول والشرائح الزجاجية. ضع الكابولي المغسول على شريحة زجاجية نظيفة. انقل الشرائح الزجاجية الوظيفية إلى جرة التلوين.

عالج كلاهما في فرن على حرارة 110 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتخزين عينات الزجاج السيلاني والكبولي في مجفف مفرغ لمدة تصل إلى أسبوع واحد. عندما تكون جاهزا لبدء تثبيت البروتينات بشكل عشوائي ، قم بإعداد محلول يحتوي على EDC و NHS في محلول ملحي قياسي مخزن بالفوسفات كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بتغطية الشرائح الزجاجية المطلية بالسيلان بهذا المحلول. ضع مجسات الكابولي السيلانية في قطرة من محلول ECD / NHS. احتضن كلاهما لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، اشطف كل من الكابول والشرائح في ثلاثة أكواب متتالية لغسل أي EDC / NHS الزائدة تماما. انقل شرائح الزجاج المنشط إلى طبق بتري مزود بمنديل مبلل. أضف قطرة من محلول البروتين المطلوب إلى المنطقة التي يتم تنشيطها بواسطة EDC / NHS من الشرائح الزجاجية وأغلق طبق بتري باستخدام البارافيلم واحتضان المجسات في درجة حرارة الغرفة.

أضف قطرة من محلول البروتين المطلوب إلى صندوق الكابولي المجهز بمنديل مبلل. ثم اغسل مجسات الكابولي جيدا باستخدام PBS. ضع المجسات في القطرة في الصندوق وأغلق الصندوق.

احتضان المجسات في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع علامة على منطقة قطرة البروتين على الجانب الخلفي من الشرائح الزجاجية. اغسل كل من الشرائح الزجاجية ومجسات الكابولي جيدا باستخدام ثلاثة أكواب متتالية مملوءة ب PBS.

ضع المجسات المغسولة في وعاء يحتوي على محلول ملحي مخزن في تريس لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح الزجاجية ومجسات الكابولي جيدا باستخدام PBS. قم بتخزينها في أطباق بتري منفصلة مغطاة ب PBS حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

قم بتثبيت شريحة زجاجية تم تنظيفها حديثا على حامل عينة AFM وقم بتغطيتها بمخزن PBS. بعد ذلك ، قم بتثبيت مسبار الكابولي المعد في حامل الكابولي وضعه في رأس AFM. بلل الكابول بعناية بقطرة من المخزن المؤقت PBS.

حرك الكابول ببطء نحو سطح المعايرة حتى يتم غمر الكابول تماما في المخزن المؤقت PBS ، ولكنه لا يزال بعيدا عن سطح المعايرة. استخدم إما المجهر البصري للرؤية العلوية أو المجهر المقلوب ل AFM لوضع الليزر على الجانب الخلفي من الكابولي. ضع بقعة الليزر بالقرب من نهاية الكابولي بالقرب من مكان وجود الطرف واضبط الموضع في الصمام الثنائي الضوئي للكاشف المكون من أربعة أرباع في AFM بحيث يتم وضع شعاع الليزر المنعكس في وسط الصمام الثنائي الضوئي.

بعد ذلك ، افتح مدير المعايرة في برنامج AFM. لبدء معايرة حساسية الكابولي وثابت الزنبرك ، اقترب بعناية من سطح الركيزة وسجل منحنى مسافة القوة. قم بتركيب خط مستقيم على الجزء الأكثر انحدارا من منحنى قوة التراجع حيث يكون الطرف ملامسا لسطح الركيزة لتحديد حساسية الرافعة البصرية.

اسحب الكابول من سطح العينة وسجل العديد من أطياف الضوضاء الحرارية باستخدام الكابول على بعد 100 ميكرون على الأقل من السطح وقم بتركيب مذبذب توافقي ، يوفره برنامج AFM ، إلى أطياف الضوضاء الحرارية لتحديد ثابت الزنبرك للناتئ. بعد ذلك ، اسحب الكابولي ببطء واسحبه من المحلول. قم بإزالة السطح الزجاجي المستخدم في معايرة الكابولي واستبدله بسطح العينة الذي يحتوي على البروتينات الثابتة.

حرك الكابول الرطب ببطء نحو سطح العينة حتى يتم تغطية الكابول بالكامل بواسطة المخزن المؤقت PBS ، ومع ذلك لا يزال بعيدا عن سطح الركيزة. اقترب من السطح وسجل منحنيات مسافة قوة متعددة في مواقع مختلفة على سطح العينة بقوة تلامس تبلغ 250 بيكنوتن ، ووقت تلامس يبلغ ثانية واحدة ، وطول تراجع يبلغ ميكرومترين وسرعة تراجع تبلغ ميكرومتر واحد في الثانية. في برنامج معالجة البيانات ، حدد أيقونة فتح الدفعة من Force Scanning لفتح ملفات منحنى القوة المقاسة.

حدد أيقونة إعادة معايرة انحراف V عن طريق ضبط الحساسية في ثابت الربيع لتحويل انحراف الكابولي إلى القوة المتنابية مباشرة. بعد ذلك ، حدد أيقونة طرح خط الأساس لطرح خط الأساس لقناة التراجع في منطقة من منحنى القوة بعيدا عن السطح ، والتي تحدد أيضا مستوى القوة الصفرية. حدد أيقونة تحديد نقطة الاتصال لتحديد النقطة التي يلامس فيها الطرف العينة.

حدد أيقونة فصل عينة التلميح لتحويل إشارة الارتفاع إلى فصل عينة الطرف. بالإضافة إلى طرح موضع نقطة التلامس ، فإن هذا يطرح الانحناء الكابولي لحساب المسافة بين سطح الركيزة وطرف AFM. حدد أيقونة Fit a Polymer Chain Model'com واختر نموذج السلسلة الشبيهة بالدودة القابلة للتوسيع لفحص آثار مسافة القوة لقمم القوة التي تحدث بأطوال تمزق تزيد عن 70 نانومتر.

قم بفرز التفاعلات غير المحددة وقم بتطبيق نموذج السلسلة الشبيهة بالدودة القابل للتوسيع على القمم المحددة. في هذه الدراسة ، يتم تجميد البروتينات تساهميا بتوجيه عشوائي عبر الأمينات الأولية التي يمكن الوصول إليها. تظهر صورة AFM لطبقة البوليمر السيلانية تمويجات سطحية صغيرة فقط بارتفاعات تتراوح بين اثنين وخمسة نانومتر تقريبا.

ومع ذلك ، ينظر إلى أن السطح الذي يعمل بالفيبرونيكتين يحتوي على جزيئات فيبرونيكتين يبلغ ارتفاعها حوالي 10 نانومتر. يكشف الفحص الدقيق أنه يمكن التعرف على التركيب الثنائي للجزيئات. يبدو أن هذه الجزيئات مضغوطة ، بارتفاع يتراوح من أربعة إلى خمسة نانومترات فوق طلاء سطح PEG ويبلغ طولها حوالي 120 نانومتر.

ثم يتم فحص قوى تفاعل RRGA مع الفيبرونيكتين. أظهرت منحنيات فصل عينة الطرف التمثيلية المسجلة بسرعة قطبية تبلغ ميكرون واحد في الثانية تفاعلا منخفضا في الخلفية وأحداث تفاعل جيدة الشكل ، والتي يتم تركيبها بعد ذلك ، باستخدام نموذج سلسلة يشبه الدودة قابل للتوسيع. يظهر رسم نتائج هذا الملاءمة أنه بعد التغلب على التفاعلات السطحية غير المحددة في تمديد روابط PEG ، فإن ما يصل إلى 19٪ من منحنيات القوة لها أحداث تمزق بمتوسط قوة تمزق تبلغ 52 بيكونوتون لتفاعل الفبرونيكتين RRGA وعلى مسافة عينة طرف تبلغ حوالي 100 نانومتر.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه اعتمادا على إعدادات مثل وقت الاتصال أو سرعة التراجع ، تحتوي بيانات التحليل الطيفي لقوة الجزيء الفردي على معلومات متعددة وأن هذا البروتوكول يمكن أن يكون فقط خطوة أولى نحو تحليل البيانات الكامل. في حين أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول تفاعلات الجزيء الفردي ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لدراسة التفاعلات على مستوى الخلية الواحدة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحليل الطيفي لقوة الخلية المفردة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، كيف تتفاعل الخلايا الكاملة مع الأسطح المغلفة بالبروتين.

لا تنس أن العمل مع الأحماض والأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات مثل القفازات المقاومة للأحماض وغرفة غير منفذة للأشعة فوق البنفسجية يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.