المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة تأثير الحمل الميكانيكي على الانقسام المحلل للبروتينات المفردة بطريقة متوازية للغاية وفعالة من حيث التكلفة. في هذا العرض التوضيحي ، يتم فحص انقسام الكولاجين بواسطة مصفوفة البروتين المعدني في الخطوة الأولى ، ويتم إرفاق قادين الكولاجين بزلة الغطاء الزجاجي لخلية التدفق ، متبوعا بربط حبات مغناطيسية بحجم ميكرومتر بجزيئات الكولاجين الفردية. تتمثل الخطوة الثانية في تركيب خلية التدفق في جهاز الملقط المغناطيسي والتحقق من إزالة الخرزات غير المرفقة بشكل محدد من سطح انزلاق الغطاء.

بعد ذلك ، يضاف البروتياز إلى خلايا التدفق. الخطوة الأخيرة هي تحديد معدل تحلل البروتين عن طريق مراقبة انفصال الخرزة في الوقت الفعلي. من خلال قياس معدلات انفصال الخرزة بتركيزات وقوى مختلفة من البروتياز ، من الممكن اشتقاق المعلمات الحركية الحيوانية القياسية باستخدام كميات دقيقة من الركيزة والبروتياز.

بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه التقنية معلومات فريدة حول تأثير القوة الميكانيكية على معدل تحلل البروتين وعلى التغيرات الهيكلية في بروتين الركيزة المصاحب للانقسام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى مثل آثار T البصرية والفحص المجهري للقوة الذرية ، هي أن هذه التقنية عالية الإنتاجية وفعالة من حيث التكلفة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للقوة الفعالة على الانقسام المحلل للبروتينات المفردة ، إلا أنه يمكن تطبيق الأجهزة والتقنيات على مجموعة واسعة من المشكلات الفيزيائية الحيوية ، بما في ذلك تأثير القوة على طي البروتين وتأكيده.

ابدأ في إعداد خلية التدفق عن طريق تنظيف زلات الغطاء باستخدام الصوتنة. أضف زلات الغطاء إلى وعاء زجاجي صغير قادر على حملها يناسب الجهاز. املأ الحاوية بالأيزوبروبانول والصوتين في جهاز الاستحمام لمدة 20 دقيقة ، وقم بشطف الأيزوبروبانول وشطف زلات الغطاء بكميات وفيرة من الماء منزوع الأيونات.

املأ الحاوية بالماء وصوتنة لمدة 20 دقيقة. بعد الصوتنة ، ينزلق الغطاء في تيار من الهواء الخالي من الغبار المصفى. افحص زلات الغطاء واستخدم فقط تلك الخالية من اللطخات.

قم بإشعال زلاقات الغطاء برفق لبضع ثوان لتنظيفها من أي غبار ورطوبة متبقية عن طريق تمرير الغطاء. ينزلق من خلال لهب الغاز الناتج عن موقد بنسن ، مع الحرص على عدم تشويه انزلاق الغطاء بسبب الحرارة الزائدة. تزيل هذه الخطوة الملوثات السطحية المتبقية.

بعد ذلك ، استخدم شريطا سكوتش على الوجهين لإرفاق زلات الغطاء معا. عن طريق قص الشريط أولا بطول ثلاثة سنتيمترات تقريبا وعرض 0.3 سم ، قم بتوصيل الشريط بزلة غطاء مقاس 22 × 40 ملم ، مع ترك قناة 1.6 سم في المنتصف. استخدم طرف الماصة للضغط برفق على زلة الغطاء للتأكد من أن الشريط ملتصق بشكل صحيح.

تم بناء جهاز الملقط المغناطيسي بواسطة هذا المختبر باستخدام قوس من الألومنيوم L بثقب قطره ملليمتر واحد ومثبت على مترجم Z عمودي لتعديل ارتفاع الملقط. تم إرفاق مغناطيسين أرضيين نادرين دائمين بالقوس على جانبي الثقب لإنشاء تدرج المجال المغناطيسي. المعايرة المناسبة للمصيدة المغناطيسية ضرورية لهذا الإجراء.

لضمان النجاح ، نستخدم طريقتين مختلفتين كما هو موضح في هذا القسم. لمعايرة المصيدة المغناطيسية للمعايرة ، استخدم الحمض النووي المعد مسبقا من عاثية لامدا المسمى في نهايته الخمسة الأولية والثلاثة الأولية مع البيوتين والأكسجين كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. لربط الحمض النووي بخلية التدفق أولا ، املأ خلية التدفق بمحلول الأكسجين المضاد D والأجسام المضادة واترك الجسم المضاد يلتصق بالسطح الزجاجي لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، أكل سطح خلية التدفق لمنع الالتصاق غير المحدد للحمض النووي عن طريق إضافة محلول BSA إلى خلية التدفق. لاحظ أنه بالنسبة لهذه الخطوة وجميع الخطوات اللاحقة ، يجب أن يكون حجم الكاشف المضاف إلى خلية التدفق مزدوجا على الأقل. حجم خلية التدفق ، والتي تبلغ في هذا العرض التوضيحي 75 ميكرولترا ، تحتضن خلية التدفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.

بعد تكرار هذه الخطوة ، أضف 50 صورا بيكو من حمض نووي لامدا الوظيفي واتركه يلتصق بقلة الغطاء لمدة 15 دقيقة ، واغسل الحمض النووي الزائد باستخدام XPBS واحد. أخيرا ، أضف حبات مغناطيسية فائقة المغلفة بالستربتافيدين واتركها تلتصق بالحمض النووي الثابت لمدة 15 دقيقة. في هذا العرض التوضيحي ، يتم استخدام حبات 2.8 ميكرومتر.

اغسل الخرزات الزائدة باستخدام XPBS واحد. بعد ذلك ، قم بإجراء معايرة الملقط المغناطيسي عن طريق تحريك المغناطيس الدائم إلى موضع بعيد عن سطح العينة. ثم ضع خلية التدفق المحضرة في المجهر.

حرك المغناطيس الدائم إلى موضعه فوق خلية التدفق. اختر المستوى البؤري لخرز Lambda DNA الوظيفي من خلال التركيز على الخرزات بعيدا عن كلا السطحين الزجاجيين. المستوى البؤري الصحيح هو المستوى الذي يكون فيه للحبات المرغوبة مركز ساطع.

التقط مقطع فيديو لحركة الخرزة التي تكون 80 هرتز أكبر مقابل 500 إطار. حرك المغناطيس بالقرب من سطح العينة وسجل مقطع فيديو لحركة الخرزة في كل موضع. بالنسبة للمسافات التي تتجاوز خمسة ملليمترات، تحرك بزيادات ملليمتر واحد للمسافات بين ملليمترات وخمسة ملليمترات.

تحرك بزيادات قدرها 0.5 ملم للمسافات التي تقل عن ملليمتر واحد ، وتحرك بزيادات قدرها 0.25 ملم لكل مجموعة بيانات ، تتبع مركز الخرزات باستخدام ملاءمة Gaussian ثنائية الأبعاد. حساب القوة عن طريق التقلبات البراونية كما هو موضح في الإجراء المكتوب. تأكد من دقة القوى عن طريق التحقق من حساب القوة عبر طيف الطاقة Lian Fit.

من أجل العثور على تردد التدحرج ، يمكن العثور على العلاقة بين القوة المطبقة وتردد التدحرج في النص قبل ربط ببتيد الكولاجين بخلايا التدفق ، والتعبير عن ببتيد الكولاجين وبروتينات MMP one والتعبير عن وتنقية ببتيد الكولاجين. ابدأ بإضافة محلول الأجسام المضادة للميكروفون إلى خلية التدفق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح للميكروفون المضاد بالالتصاق بسطح خلية التدفق ، وأكل خلية التدفق لمنع الارتباط غير المحدد للبروتينات باستخدام خمسة ملليغرام لكل مليلتر. BSA أضف 150 ببتيد كولاجين بيكوملار واتركه يلتصق بالجسم المضاد عبر M ttag لمدة 45 دقيقة.

اغسل الكولاجين الزائد باستخدام PBS المؤقت قبل إضافة حبات 2.8 ميكرومتر إلى خلية التدفق. يجب فصلها عن محلول الخرزة العقدية والمغلفة باستخدام مغناطيس قوي ، ثم إعادة تعليقها في PBS. يجب تكرار هذه العملية ثلاث مرات.

هذه الخطوة ضرورية للحصول على حبات 2.8 ميكرومتر للارتباط بببتيد الكولاجين الثابت على السطح. بعد ذلك ، أضف حبيبات مغناطيسية فائقة المغلفة بالستربتافيدين العقدية واتركها تلتصق بجزيئات الكولاجين لمدة 45 دقيقة. بمجرد تجميع خلية التدفق مع ببتيد الكولاجين والخرز المغناطيسي ، قم بتصوير خلية التدفق في المصيدة المغناطيسية.

تحت القوة المنخفضة ، تكون مجموعة سكانية فرعية من الخرز ضعيفة في بعض الأحيان ، ويتم التصاق بالسطح بطريقة غير محددة. يضمن تطبيق القوة المتواضعة تحرير هذه الخرز. أضف الإنزيم المنشط إلى خلية التدفق.

في هذه الحالة ، تم تنشيط MMP واحد مسبقا عن طريق إضافة 3.5 مللي مولار A PMA وتحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بمجرد إعادة إدخال خلية التدفق في جهاز الملقط المغناطيسي ، قم بتسجيل مقطع فيديو يمتد عبر عدد قليل من مجالات الرؤية ، وعادة ما ينتج عنه عدة مئات من الخرز المرفق. يتوافق هذا القياس مع الوقت يساوي صفرا.

كرر نفس العملية المتمثلة في تسجيل العديد من مجالات الرؤية في نقاط زمنية منتظمة حتى تنفصل جميع الخرزات أو لا يمكن تمييز المزيد من الانحلال البروتيني. تمت معايرة الملقط المغناطيسي لخرز ميكرومتر واحد و 2.8 ميكرومتر. باستخدام كل من حجم التقلبات البراونية المرصودة وحساب تردد التدحرج في مواضع مغناطيسية مختلفة في تجارب تحلل البروتين القسري ، يمكن رسم العدد الطبيعي للحبات المتبقية كدالة للوقت للعثور على معدل تحلل البروتين.

ويمكن تكرار هذه العملية لتركيزات وقوى الإنزيم المختلفة. تعتمد معدلات تحلل البروتين على القوة المطبقة. تم تحديد معدلات تحلل البروتين عند بيكو نيوتن واحد ، 6.2 بيكو نيوتن ، و 13 بيكو نيوتن.

يقع جزء الخرز غير الإيجابي في أكثر من 15 دقيقة ، ويظل ثابتا تقريبا عند 0.25 عبر التجارب المختلفة. في حالتنا ، سمح لنا الاختبار بقياس الكفاءة التحفيزية ل MMP واحد كدالة للقوة المطبقة. من خلال تحليل البيانات ، وجدنا أن حلزون الكولاجين الثلاثي يجب أن يرتاح محليا قبل التحلل البروتيني.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمس إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. من المهم أن تتذكر أن ما لا يقل عن 30 إلى 50 خرزة لكل وقود عرض مطلوب للحصول على أهمية إحصائية جيدة لبياناتك. لا تنس أن سلطة النقد الفلسطينية يمكن أن تكون خطيرة للغاية ويجب دائما استخدام الاحتياطات مثل القفازات ومعاطف المختبر وقناع الوجه أثناء إجراء هذه التجربة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس تأثير القوة على الانقسام المحلل للبروتينات المفردة باستخدام ملاقط مغناطيسية. تعتبر الملقط المغناطيسي أداة رائعة لفهم التجارب الفيزيائية الحيوية للجزيء الواحد. يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل مجموعات البروتياز والركيزة الأخرى.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تقنيات مماثلة لفهم الديناميكيات الهيكلية للبروتين بالإضافة إلى فهم البروتينات الأخرى التي تربط أو تعدل الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي.