Exon تخطي في الأنابيب الليووية المبرمجة مباشرة التي تم الحصول عليها من الخلايا المشتقة من البول البشري

لقد وضعنا بروتوكول جديد لإعادة برمجة الخلايا المشتقة من البول البشري مباشرة إلى ميوتوب. هذا في المختبر النمذجة تمكننا من تقييم exon تخطي في myotubes المستمدة من المريض مع ضمور العضلات دوشين. اكتشفنا أن 3-deazaneplanocin A هيدروكلوريد, DZnep, هيستون ميثيل ترانسفيراز المانع يمكن أن تعزز بشكل كبير الفحص المباشر ل UDCs في myotube في فترة قصيرة من الزمن.

هذا جديدة autologous UDC القائم على النمذجة المرض يمكن أن يؤدي إلى الطب الدقيق تطبيق لمختلف الأمراض العضلية. للبدء، الطرد المركزي عينة البول بأكملها في 400 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. المقبل، يُشعّر المُندفع الذي يترك مليلتراً واحداً في الأنبوب.

resuspend الكريات بشكل فردي في المليلتر واحد المتبقية من البول. جمع تلك في أنبوب واحد 50 ملليلتر وإضافة 10 ملليلتر من الغسيل العازلة إلى الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي العينات في 200 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

استلهمت المُنطّع ترك 0.2 ملليلتر في الأنبوب. resuspend الكريات الخلية في 4.5 ملليلتر من المتوسطة الأولية. بذور الخلايا في ثلاثة آبار من الجيلاتين المغلفة ستة جيدا لوحة، 1.5 ملليلتر من تعليق الخلية في بئر.

الثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لمدة ثلاثة أيام إضافة 1.5 ملليلتر من المتوسط الابتدائي كل يوم. في اليوم الرابع، استبدل الوسيط بـ 1.5 ملليلتر من متوسط النمو المكمل كما هو موضح في المخطوطة.

بعد اليوم الرابع، استبدال متوسط النمو المكمل كل يومين حتى ثقافة UDC هو 80 إلى 90٪ التقاء. ثم إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. تقسيم الخلايا باستخدام 0.25٪ تبسين-EDTA.

بذور الخلايا في كثافة من 3، 000 إلى 5، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع على طبق جديد المغلفة الجيلاتين 60 ملليمتر. بذور UDCs في 3، 000 إلى 5، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع على طبق 60 ملليمتر المغلفة الجيلاتين ووضع الطبق في الحاضنة. بعد 24 ساعة من البذر ، تصيب الخلايا بفيروس رجعي مذاب في عدد كبير من العدوى من 200.

استخدم وسطاً جديداً بتركيز بروميد الهيكسادي ميثرين 8 ميكروغرام لكل ملليلتر. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتحديد الخلايا التي يتم تحويلها MYOD1، استبدل الوسيط الثقافي بوسيط نمو جديد يحتوي على ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من البورومايسين.

استمر في تغيير الوسط كل يوم لمدة سبعة إلى 10 أيام. لوحة UDCs MYOD1 التي تم تحويلها في لوحة الكولاجين المغلفة متعددة جيدا. بعد احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة، قم بتغيير متوسط النمو إلى الوسط المتمايز الموصوف في المخطوطة.

ثم بعد ثلاثة أيام، وتغيير التمايز المتوسطة إلى المتوسطة التمايز الطازجة دون DZNep. استمر في تغيير الوسط كل ثلاثة أيام. لتحويل oligonucleotide antisense إلى UDCs MYOD1 التي تسببها, مزيج ASO transfection كاشف والتمايز المتوسطة إلى التركيز النهائي من واحد إلى 10 ميكرومولار.

واستخدم هذا الخليط ليحل محل الوسيلة في الآبار. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية ورطوبة 5٪. بعد 72 ساعة حضانة مع ASO، تغيير المتوسطة إلى تمايز جديد المتوسطة دون ASO.

بعد ثلاثة إلى سبعة أيام من نقل ASO ، قم بإزالة وسيط التمايز. اغسل UDCs مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة العازلة تحلل الخلية. حصاد الجيش الملكي النيبالي الكلي باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي.

قياس تركيز الحمض النووي الريبي مع مقياس الطيف. وكما هو موضح في المخطوطة، قم بجمع الكواشف لـ RT-PCR من خطوة واحدة في أنابيب البوليميراز المتعدد الكلور. ضع أنابيب PCR في الدراجات الحرارية وتشغيل الدراجات الحرارية.

تنفيذ electrophoresis رقاقة وحساب exon تخطي الكفاءة. 29- وتم جمع البلدان النامية الجزرية الموحدة بسهولة وبشكل غير تلقائي وشكلت مستعمرات في غضون أسبوع من الثقافة الأولية. MYOD1 عبر العدوى UDCs في المتوسط التمايز مع DZNep يمكن أن تصهر لبعضها البعض وشكلت ميوتوب متعددة النوى بكفاءة.

RT-PCR اكتشفت بوضوح exon تخطي في MYOD1-UDCs المستمدة من المرضى الذين يعانون من ضمور العضلات دوشين. وكان تخطي الكفاءة يعتمد على جرعة ASO. كما تم الكشف عن تخطي إكسون المعتمد على الجرعة بواسطة لطخة غربية.

تم قياس شدة الديستروفين مع المجهر الفلورسنت بعد أسبوع واحد من نقل ASO. ولوحظت إشارات فلورية أعلى بشكل ملحوظ في MYOD1-UDCs تعامل مع ASO مما كانت عليه في عنصر التحكم. يمكننا نماثة أي مرض عضلي يؤدي إلى فهم الفيزيولوجيا المرضية لتلك الأمراض.