توليد وصيانة وتوصيف العضيات المعوية والقولونية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

يصف البروتوكول التالي جيلا من العضيات المعوية والقولونية البشرية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. ستسمح هذه التقنية للمستخدم باستجواب المسارات المشاركة في الزخرفة المعوية. تسمح هذه التقنية للمستخدم بإنشاء عضيات خاصة بالمنطقة متساوية المنشأ. يمكن أن يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة للعوامل التي تنظم إنشاء وصيانة الزخرفة المعوية.

[راوي] ابدأ بوضع مصفوفة خارج الخلية أو لوحة 24 بئرا مطلية ب ECM داخل خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة للسماح لها بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة. ضع محلول انفصال الخلايا المتوسطة الكامل mTeSR1 و DMEM المتقدم داخل حمام حبة 37 درجة مئوية واتركهما يسخنان لمدة 30 دقيقة. قم بإعداد وسط الطلاء في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر عن طريق إضافة 13 مل من mTeSR1 و 13 ميكرولتر من 10 ملليمولار Y-27632 بروتين كيناز مرتبط ب Rho أو مثبط ROCK. لجمع الخلايا من لوحة الآبار الستة ، قم بشفط الوسط من ثلاثة إلى أربعة آبار واغسله مرة واحدة بملليلتر من DMEM المتقدم لكل بئر. استنشق DMEM المتقدمة ، ووزع مليلترا واحدا من محلول تفكك الخلية في كل بئر. احتضن الطبق لمدة خمس إلى سبع دقائق داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ ، 37 درجة مئوية. قم بفصل أي كتل من الخلايا عن طريق سحب العاصة لأعلى ولأسفل أربع إلى خمس مرات باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر لتحضير تعليق الخلية. أضف ملليلترين من DMEM المتقدم إلى كل بئر. قم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل من أربع إلى خمس مرات ثم انقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. قم بتدوير الخلايا عند 300 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشاق الوسط من الأنبوب دون شفط حبيبات الخلية. وأضف ستة ملليلتر من الوسط المحضر من mTeSR1 بالإضافة إلى مثبط ROCK. أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ثلاث إلى أربع مرات. ثم انقل التعليق إلى بقية وسط مثبط mTeSR1 و ROCK داخل أنبوب 50 مل. أعد التعليق بقوة من أربع إلى خمس مرات وعد الخلايا باستخدام مقياس الخلايا. استنشق وحدة التحكم في المحرك من اللوحة المكونة من 24 بئرا قبل طلاء الخلايا مباشرة. أعد تعليق الخلايا مرة أخرى عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات ، وتوزيع 0.5 مل من تعليق الخلية في كل بئر. هز اللوحة برفق ثلاث مرات في اتجاه عقارب الساعة ، وثلاث مرات عكس اتجاه عقارب الساعة ، وثلاث مرات للأمام والخلف ، وثلاث مرات من جانب إلى آخر لتفريق الخلايا بالتساوي. انقل الطبق إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية ، 5٪ ، واحتضن لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، استنشاق الوسط المستهلك. أضف 0.5 مل لكل بئر من mTeSR1 ، واحتضن مرة أخرى لمدة 24 ساعة في نفس الظروف. قم بإعداد وسيط Activin لليوم الأول الكامل عن طريق تخفيف 100 ميكروغرام لكل مليلتر من محلول Activin A ، و 100 ميكروغرام لكل مليلتر BMP4 في وسط Activin في اليوم الأول في أنبوب مخروطي. قم بتسخين الوسط في حمام حبة 37 درجة مئوية. استنشق وسيط mTeSR1 من اللوحة المكونة من 24 بئرا وأضف 0.5 مل من وسيط Activin Day One لكل بئر. ضع الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية ، 5٪ ، واحتضن لمدة 24 ساعة. افحص الخلايا بعد 24 ساعة. قم بإعداد Activin في اليوم الثاني من الوسط الكامل عن طريق تخفيف محلول مخزون 100 ميكروغرام لكل مليلتر Activin A في وسط Activin في اليوم الثاني في أنبوب مخروطي ، وضع الأنبوب في حمام حبة 37 درجة مئوية. قم بإزالة لوحة التمايز 24 بئرا من حاضنة ثاني أكسيد الكربون ، وقم بإزالة الوسط المستهلك. قم بتوزيع 0.5 مل من الوسط المسخن مسبقا في اليوم الثاني لكل بئر ، ثم ضع اللوحة مرة أخرى داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. قم بإعداد Activin اليوم الثالث من الوسط الكامل عن طريق تخفيف محلول مخزون 100 ميكروغرام لكل مليلتر Activin A في وسط Activin في اليوم الثالث في أنبوب مخروطي ، وضع الأنبوب في حمام حبة 37 درجة مئوية. قم بإزالة الوسط المستهلك ، واستغني عن 0.5 مل من Activin day three وسط لكل بئر. لتبدأ بتمييز الأديم الباطن النهائي إلى كروية منتصف الأمعاء الخلفية ، أضف 25 مل من وسط الحث في منتصف المعى الخلفي مع FGF4 في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، وضعه في حمام حبة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لتحضير وسط الحث الكامل في منتصف المعى الخلفي ، أضف 7.5 ميكرولتر من CHIR99021 بعد أن يصبح الوسط دافئا. قم بإزالة الوسط المستهلك ، ووزع 0.5 مل من وسط الحث في منتصف الأمعاء الخلفية لكل بئر ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد حدوث تكثيف الخلايا داخل الطبقة الأحادية في اليوم التالي ، استبدل الوسط المستهلك بوسط تحريض جديد في منتصف المعى الخلفي وضع اللوحة مرة أخرى للحضانة لمدة 24 ساعة. لتجنب التخلص من الكروية العائمة أثناء تغيير الوسيط ، انقل الوسيط القديم إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 جم لمدة دقيقة واحدة. أعد تعليق الكروية في 12.5 مل من وسط الحث الطازج في منتصف الأمعاء الخلفية ، وأضف 0.5 مل لكل بئر في نفس اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واحتضن لمدة 24 ساعة في الحاضنة. في اليوم الرابع من تحريض الأمعاء الخلفية ، قم بحصاد الكروية العائمة من آبار الصفيحة عن طريق جمع الوسط في أنبوب 15 ملليلتر ، متبوعا بالطرد المركزي عند 300 جم لمدة دقيقة واحدة. تم تقييم كفاءة تحريض الأديم الباطن النهائي عن طريق إجراء تلطيخ التألق المناعي ل FOXA2 و SOX17. تم العثور على التعبير عن mRNA لعامل HOX الأمامي HOXD3 ليكون الأعلى في عضيات الأمعاء البشرية المعالجة ب Noggin أو HIOs ، وأقل في عامل النمو الظهاري أو HIOs المعالجة ب EGF ، والأدنى في عضيات القولون البشرية المعالجة ب BMP أو HCOs. على العكس من ذلك ، تم العثور على تعبيرات HOXA13 و HOXD13 mRNA منخفضة في HIOs وعالية في HCOs. تم إجراء تلطيخ التألق المناعي ل SATB2 و CDX2 و CDH1 لتحديد ما إذا كانت ظهارة HCO منقوشة بشكل صحيح.