نمذجة موقع نشط إنزيم باستخدام التصور الجزيئي مجانية
December 25th, 2021
مهارة رئيسية في النمذجة الجزيئية الحيوية هو عرض والتعليق على المواقع النشطة في البروتينات. وقد أثبتت هذه التقنية باستخدام أربعة برامج شعبية مجانية للتصور الجزيئي الكلي: iCn3D، Jmol، PyMOL، وUCSF ChimeraX.
يعتبر تصور الجزيئات البيولوجية الكبيرة مهارة حاسمة للطلاب والمهنيين في العلوم البيولوجية. في هذا البروتوكول، ونحن نبين كيفية نموذج الموقع النشط للإنزيم glucokinase باستخدام أربعة برامج متاحة بحرية للنمذجة الجزيئية. يسلط هذا البرنامج التعليمي الضوء على عدة خطوات من البروتوكول لكل برنامج ، والذي يتضمن اختيار الليجاندات المقيدة واستخدام الليغاند لعرض الأحماض الأمينية وجزيئات الماء داخل خمسة angstroms.
تحتوي المعلومات الداعمة لهذه المخطوطة على فيديو مخصص لكل برنامج، والذي يفصل جميع خطوات البروتوكول مع مزيد من التوضيح. الهيكل سوف نموذج PDBID. يمثل 3FGU المركب الحفاز لانزيم الجلوكوكيناز.
يرتبط الموقع النشط للإنزيم باثنين من ركائزه ، بيتا -D-Glucose ، والتي أعطت معرف BGC وأيون المغنيسيوم ، MG. بالإضافة إلى ذلك، هذا التناظرية الركيزة، وحمض فوسفو الفوسفوريك الأميني، استر أدينيلات، ANP لا بد أن موقع glucokinase النشطة. هذا التناظرية غير القابلة للتحلل من أدينوسين ثلاثي الفوسفات، ATP يمنع رد فعل الفوسفور من الحدوث، الذي يلتقط مجمع الموقع النشط قبل الحفز. واجهة برنامج النمذجة UCSF ChimeraX يحتوي على القوائم المنسدلة وشريط أدوات عارض البنية وخط الأوامر.
سنبدأ البروتوكول بالخطوة 1.4، ونختار المخلفات ضمن خمسة أنغستروم لتحديد موقع نشط. لتحديد ليغيندس الصحافة التحكم التحول وانقر على أي ذرة أو السندات في كل من ليغاندس الثلاثة. اضغط على مفتاح السهم لأعلى حتى يتم تمييز جميع الليجاندس الثلاثة بتوهج أخضر.
حدد التحديد للاستخدام المستقبلي بالنقر في القائمة المنسدلة، وحدد تحديد محدد، واكتب الليجاندات لاسم التحديد وانقر فوق موافق. مرة أخرى، باستخدام القائمة المحددة، حدد المنطقة. تبديل هذا إلى بقايا وتأكد من أن يتم فحص المربع العلوي.
انقر فوق موافق. لاحظ أن أجزاء من الرسوم المتحركة داخل خمسة angstroms من هذه ligands يتم تسليط الضوء. لعرض السلاسل الجانبية والعصي وتظهر جزيئات الماء بالموقع النشط استخدام الإجراءات ذرة السندات القائمة لتبين لهم.
أو تبديلها مع هذه الأزرار هنا. لمسح التحديد، انقر فوق أي مكان في المساحة الفارغة. وينبغي أن تكون النتيجة النهائية لهذا البروتوكول نموذجا مع الموقع النشط للبروتين و ligands كما هو مبين العصي الملونة بطريقة متناقضة.
وتظهر التفاعلات الربط القطبي الرئيسية مع خطوط منقط وبعض المخلفات جعل الاتصالات وصفت. تحتوي واجهة iCn3D على قوائم منسدلة، عارض البنية وسجل أوامر. تعرض طريقة العرض هذه مجموعات التحديد والتسلسل والتعليقات التوضيحية القوائم المنبثقة، والتي تظهر كما ينفذ المستخدم الأوامر التي تتطلبها.
سنبدأ البروتوكول في الخطوة 2.4، واختيار المخلفات ضمن خمسة angstroms لتحديد موقع نشط. لتحديد ligands، استخدم القائمة المنسدلة حدد وانقر فوق تحديد على 3D، تأكد من أن يتم التحقق من بقايا. اضغط باستمرار على زر البديل على جهاز كمبيوتر أو زر الخيار على ماك، انقر على ligand الأولى.
ثم اضغط على التحكم وانقر على اثنين من ليغان المتبقية لإضافتها إلى التحديد. حفظ التحديد باستخدام القائمة المنسدلة، انقر فوق تحديد، حفظ التحديد، إدخال اسم وانقر فوق حفظ. ستظهر القائمة المنبثقة مجموعات التحديد الآن مع تحديد الليجاندات الثلاثة.
الآن حدد المخلفات داخل خمسة angstroms من الليغند. استخدم القائمة المنسدلة حدد حسب المسافة. في القائمة المنبثقة التي تظهر، قم بتغيير رمح العنصر الثاني مع نصف قطر إلى خمسة angstroms عن طريق الكتابة في الكتلة، انقر فوق العرض.
ثم أغلق النافذة بالنقر على X في الزاوية اليمنى العليا. حفظ موقع نشط angstrom خمسة بالنقر فوق القائمة المنسدلة، حدد حفظ التحديد واستخدام لوحة المفاتيح لإدخال اسم. ثم انقر فوق حفظ.
الآن إنشاء تحديد جديد يجمع بين المجموعتين. يمكن دمج هذه في القائمة المنبثقة مجموعات تحديد. على جهاز كمبيوتر، انقر فوق عنصر التحكم على مجموعتين أو فوق أمر Mac.
مرة أخرى، انقر فوق القائمة المنسدلة، وحدد حفظ التحديد واكتب اسما جديدا ثم انقر فوق حفظ. لإظهار التفاعلات مثل روابط الهيدروجين استخدم قائمة التحليل وحدد التفاعلات. سنكون مهتمين فقط بروابط الهيدروجين وجسور الملح هنا
لذا سنقوم بإلغاء تحديد بقية هذه. سنختار ثلاثة ليغاند وبالنسبة لمجموعة ثانية، والمخلفات داخل خمسة angstroms.
انقر فوق تفاعلات العرض ثلاثي الأبعاد ثم أغلق النافذة. وهذا يدل على بعض المخلفات التي تتفاعل لكنها لا تظهر كامل موقع نشط angstrom الخمسة. لعرض التي ستستخدم قائمة تحديد مجموعات مرة أخرى.
انقر على خمسة angstrom الكامل ومن ثم في القائمة المنسدلة، انقر فوق نمط السلاسل الجانبية، والعصي. لتطبيق تلوين CPK، انقر على القائمة المنسدلة اللون وانقر فوق الذرة. وينبغي أن تكون النتيجة النهائية للبروتوكول نموذجا يشبه هذا مع الموقع النشط للبروتين وليجاند كما هو مبين العصي الملونة بطريقة متناقضة.
تظهر تفاعلات الربط الهامة مع خطوط منقطة ويتم تسمية كافة المخلفات داخل أحد التحديدات التي تم إنشاؤها أثناء البروتوكول. تحتوي واجهة Jmol على قوائم منسدلة وشريط أدوات عارض البنية وقائمة منبثقة وحدة تحكم Jmol التي تحتوي على سطر الأوامر. نبدأ بروتوكول Jmol في الخطوة 3.4 ، واختيار المخلفات داخل خمسة angstroms لتحديد موقع نشط.
وحدة التحكم Jmol هو أفضل وسيلة لتحديد المخلفات داخل خمسة angstroms. اكتب هذا الأمر لتحديد المخلفات داخل خمسة angstroms من الليجاندات الثلاثة. يتم اختيار 193 ذرة ولكن هذه لا تمثل بقايا الأحماض الأمينية الكاملة.
لتحديد هذه، استخدم الأمر المكتوب، وحدد داخل (مجموعة، محددة) واضغط على إدخال. لاحظ ظهور هالات التحديد الإضافية. لإظهار هذه المخلفات والعصي، انقر بزر الماوس الأيمن لإحضار القائمة المنبثقة، تحوم فوق نمط، مخطط ومن ثم انقر فوق العصي.
لاحظ أنه لا تزال هناك بعض الهالات الفارغة هنا. هذه هي جزيئات الماء في الموقع النشط. لتحديد جزيئات الماء فقط، يمكننا إعادة تنفيذ هذا الأمر ومن ثم تعديله.
انقر داخل وحدة التحكم ثم استخدم مفاتيح الأسهم لأعلى للعثور على هذا الأمر وانقر فوق إدخال لإعادة تنفيذه. لعرض جزيئات الماء كذرات، نريد إزالة اختيار الليغند والبروتين. سنكتب أمرين للقيام بذلك.
وتعتبر لدينا ligans مجموعات هيتيرو ولكن يعتبر الماء أيضا واحدة. لذا ضمن هذا الأمر، نحن بحاجة إلى تعريف أننا لا نزيل الماء. اضغط على الدخول والآن يتم اختيار جزيئات الماء فقط.
انقر على القائمة المنسدلة للعرض، تحوم فوق الذرة وانقر فوق 20٪ من نصف قطر فان دير وال. لا يزال يظهر أيون المغنيسيوم الأخضر كعصي. تظهر الأيونات بشكل أكثر شيوعا كمجالات.
انقر في وحدة Jmol ثم اكتب حدد MG ثم ملء المساحة 50٪ يتم تلوين السلاسل الداخلية بشكل متطابق. لتمييزها عن بعضها البعض، من المفيد إعادة تلوين الليجاند. في وحدة التحكم ، سأنفذ أمرا متعدد الخطوط ، والذي قمت بنسخه لصقه من ورقة الغش التي أفصلها في فيديو Jmol التكميلي.
وينبغي أن تكون نتيجة هذا البروتوكول نموذجا يشبه هذا مع الموقع النشط للبروتين كما هو مبين العصي. و الليجاند أظهر لنا العصي في نظام ألوان أكثر ليونة. خطوط صفراء تشير إلى التفاعلات الربط ومخلفات الفردية وصفت على النحو المطلوب.
تحتوي واجهة PyMOL على قوائم منسدلة عارض البنية ولوحة كائنات الأسماء وقائمة عناصر تحكم الماوس. سطر الأوامر الرئيسي هو أيضا المسمى في هذا الشكل. نبدأ البروتوكول البدائي في الخطوة 4.4 ، واختيار المخلفات داخل خمسة angstroms لتحديد موقع نشط.
لتحديد ligands انقر على كل واحد منهم. يظهر تحديد جديد، يمكن إعادة تسميته بالنقر فوق الزر A. باستخدام لوحة المفاتيح، حذف الحروف سيل ونوع ligans بدلا منها.
اضغط على Enter. يمكننا استخدام هذا التحديد لتحديد المنطقة المحيطة به. ابدأ بالنقر فوق الزر A وحدد عنصر القائمة المكرر.
في هذا التحديد الجديد sel01 انقر فوق A وحدد عنصر القائمة إعادة تسمية. باستخدام لوحة المفاتيح، احذف الحروف الموجودة واكتب النشطة. هذا لا يزال اختيار لدينا ثلاثة ليغاندس لذلك سيكون لدينا لتعديله مرة أخرى، وذلك باستخدام زر الإجراءات A.
انقر فوق الزر، حدد تعديل وتوسيع التحديد بخمسة angstroms. الآن لقد قبضنا على الليغند والمخلفات داخل خمسة أنغسترومس. S على زر S لتقف على المعرض.
انقر على هذا لعرض البروتين بطرق مختلفة. سنظهر هذا عرق السوس كعصي انقر في المساحة الفارغة لمسح التحديد.
وقد استولت على هذا الأحماض الأمينية داخل خمسة angstroms ولكن ليس الماء. يمكننا مرة أخرى، تكرار الاختيار وتعديله الآن لتحديد المياه فقط. في الإجراءات زر، مكررة.
يظهر التحديد 2. دعونا نعيد تسمية هذا بالماء النشط. هذه المرة سوف نستخدم الزر A لتعديل، حول لتحديد الذرات حول اختيارنا.
ذرات داخل أربعة أنغسترومس. وقد اختار هذا الماء ولكن أيضا بعض ذرات من السلاسل الجانبية. لتعديل هذا أكثر، استخدم الزر A لتعديل المذيبات وتقييدها.
الآن يمكننا أن نرى فقط جزيئات الماء مضاءة. مرة أخرى في الزر A، يمكننا تطبيق مسبقا. حدد مسبقا، والكرة والعصا والآن تظهر جزيئات الماء كمجالات.
النتيجة النهائية للبروتوكول هو النموذج الذي يبدو مثل هذا مع الموقع النشط في ligands كما هو مبين العصي الملونة بطريقة متناقضة. خطوط شرطة صفراء تظهر التفاعلات الربط القطبي ومخلفات الفردية وصفت باستخدام التحديدات التي تم إنشاؤها في لوحة كائن الأسماء. أخطاء في تنفيذ البروتوكول يمكن أن يؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل.
على سبيل المثال، يتم عرض البروتين بأكمله كعصي. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، سيحتاج المستخدم أولا إلى إخفاء تمثيل العصا للبنية بأكملها. ثم إعادة تمثيل العصا للكائن الذي يسمى نشط فقط باستخدام زر S.
هنا يتم عرض النماذج التي تم إنشاؤها باستخدام كل برنامج جنبا إلى جنب. على الرغم من وجود اختلافات في عرض الإنزيم ، يمكن رؤية نفس السمات والتفاعلات الرئيسية في كل نموذج من النماذج الأربعة. يرغب المستخدم المهتم بإتقان أحد البرامج التي تحتوي على سطر أوامر في تعلم تطبيق الأوامر المكتوبة وتعديلها.
كما أشرت في بروتوكول Jmol ، أداة مفيدة هي ورقة الغش الأمر. ملف نص عادي يحتوي على رموز مستخدمة بشكل متكرر للرجوع إليها. لكي تصبح مستخدما متقدما، من المفيد فهم أي أجزاء من البروتوكول يمكن تكييفها وتعديلها.
مع الممارسة يمكن تطبيق هذه البروتوكولات لنموذج أي موقع نشط إنزيم من الفائدة.
النظرة العامة
توضح هذه المقالة مهارة النمذجة الحيوية الجزيئية من خلال تصور الموقع النشط للإنزيم glucokinase باستخدام أربعة برامج مجانية: iCn3D، وJmol، وPyMOL، وUCSF ChimeraX. يوفر البرنامج التعليمي تعليمات خطوة بخطوة للنمذجة وتعليق الموقع النشط مع الربيطات المرتبطة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- النمذجة الحيوية الجزيئية
- تصور البروتينات
- تحليل الموقع النشط للإنزيم
الخلفية
- فهم هياكل البروتينات أمر حاسم في العلوم البيولوجية.
- المواقع النشطة ضرورية لوظيفة الإنزيم والتفاعل مع الركيزة.
- تتوفر أدوات برمجية مختلفة لتصور الجزيئات الكبيرة.
- تركز هذه الدراسة على glucokinase، وهو إنزيم يشارك في استقلاب الجلوكوز.
غرض الدراسة
- لتعليم الباحثين كيفية نمذجة المواقع النشطة للإنزيم بشكل فعال.
- لمقارنة أدوات التصور الجزيئية المختلفة.
- لتوفير دليل شامل لاختيار وعرض الربيطات والبقايا.
الطرق المستخدمة
- استخدام iCn3D، وJmol، وPyMOL، وUCSF ChimeraX للنمذجة.
- بروتوكول خطوة بخطوة لاختيار البقايا داخل خمسة أنغستروم من الربيطات.
- تصور الأحماض الأمينية وجزيئات الماء القريبة من الربيطات.
- تعليق التفاعلات الرئيسية والسمات الهيكلية.
النتائج الرئيسية
- نمذجة ناجحة للموقع النشط لـ glucokinase مع الربيطات المرتبطة.
- تصور واضح للتفاعلات بين الإنزيم والركائز.
- تبرهن على قدرات كل أداة برمجية.
- إنشاء فيديو تعليمي مفصل لكل برنامج.
الخلاصات
- توفر الدراسة رؤى قيّمة في تقنيات النمذجة الحيوية الجزيئية.
- تسلط الضوء على أهمية الأدوات البرمجية في البيولوجيا البنيوية.
- يمكن للباحثين تصور وتحليل المواقع النشطة للإنزيم بشكل فعال.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Biomolecular visualization enables target validation by revealing structural determinants of ligand binding and enzyme function. Modeling active sites supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying structure-function relationships. This skill enhances predictive confidence in lead identification and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of ligand-binding interactions in the glucokinase active site.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying key amino acid residues and water molecules involved in substrate recognition.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing structural insights that inform target confidence and druggability assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological models for downstream screening by defining active site residues within five angstroms of bound ligands.
- Operational Value: Promotes assay standardization and reproducibility through consistent visualization of binding interactions across iCn3D, Jmol, PyMOL, and UCSF ChimeraX.
- Scalability: Enables platform reuse for screening campaigns by providing transferable protocols for modeling any enzyme active site of interest.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural insights to preclinical validation by maintaining consistency in active site modeling across workflows.
- Mechanistic De-risking: Highlights polar binding interactions and residue labeling to support structure-based design and lead optimization.
- Disease Relevance: Models human glucokinase, a key enzyme in glucose metabolism, relevant to diabetes and metabolic disorder target programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by enabling structural analysis of enzyme-ligand complexes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing how ligands bind to the glucokinase active site.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized selection and display of residues and water molecules in proximity to ligands.
- Analytics: Generates quantitative structural outputs such as hydrogen bond visualization and residue labeling that aid in comparing ligand-binding modes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable framework for modeling enzyme active sites in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable capability for modeling any enzyme active site, reducing redundant training and increasing cross-team consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in enzyme-ligand interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and cross-platform consistency in biomolecular visualization.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency in early discovery, and reduced biological risk in lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and binding site accessibility.
Implementation Considerations
- Requires foundational knowledge in structural biology and protein-ligand interactions.
- Needs access to computational infrastructure capable of running iCn3D, Jmol, PyMOL, or UCSF ChimeraX.
- Demands cross-team standardization of visualization protocols to ensure consistent interpretation of active site models.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different enzyme systems or ligand types.
- Limited by user proficiency in command-line interfaces and selection tools across the four software platforms.
