فحص بنية الحمض النووي الريبي مع التنميط الطفري لكبريتات ثنائي ميثيل مع التسلسل في المختبر والخلايا

DMS-MaP هي طريقة قائمة على التسلسل تسمح لنا بالحصول على لقطة لبنية الحمض النووي الريبي ، ومعرفة كيفية تغيرها في ظل ظروف مختلفة. على عكس طرق تحديد البنية التقليدية ، مثل علم البلورات والمجهر الإلكتروني ، يمكن استخدام DMS-MaP في الخلايا ومجموعات بنية الحمض النووي الريبي deconlute. نظرا لأن بنية الحمض النووي الريبي لها آثار في العديد من الظواهر البيولوجية ، فإن طريقتنا يمكن أن توفر رؤى ميكانيكية في أي مجال من مجالات البحث البيولوجي تقريبا.

ابدأ بنقل 89 ميكرولترا من المخزن المؤقت لإعادة الطي إلى أنبوب مخصص حجمه 1.5 ملليلتر لكل تفاعل حجمه النهائي 100 ميكرولتر. قم بتسخين الأنبوب عند 37 درجة مئوية في جهاز حراري يوضع أسفل غطاء كيميائي. أضف 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى أنبوب PCR ، وانقل واحدا إلى 10 بيكومول من الحمض النووي الريبي فيه.

احتضانها في دراجة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لتشويه الحمض النووي الريبي. ثم ضع الأنبوب على الفور على كتلة جليدية لتجنب اختلال الحمض النووي الريبي. الآن ، لإعادة تشكيل الحمض النووي الريبي ، أضف العينة إلى الأنبوب المخصص الذي يحتوي على المخزن المؤقت القابل لإعادة الطي عند 37 درجة مئوية واخلطه جيدا قبل احتضانه لمدة 10 إلى 20 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف ميكرولترا واحدا من كبريتات ثنائي ميثيل 100٪ ، أو DMS ، بتركيز 10.5 مولار في الأنبوب الذي يحتوي على عينة الحمض النووي الريبي ، واحتضان خليط التفاعل لمدة خمس دقائق أثناء هزه بمعدل 800 إلى 1،400 دورة في الدقيقة. بعد التفاعل لمدة خمس دقائق ، قم بإخماده ب 60 ميكرولتر من 100٪ بيتا ميركابتوإيثانول ، واخلطه جيدا قبل الدوامة ووضع الحمض النووي الريبي على الجليد على الفور. ثم قم بتنظيف الحمض النووي الريبي وإزالته في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.

تحديد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف. أخيرا ، قم بتخزين الحمض النووي الريبي المعدل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد إضافة خليط التفاعل إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، انقل ما لا يقل عن 100 نانوجرام من الحمض النووي الريبي المعدل المستخلص في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل.

احتضان الخليط عند 57 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1.5 ساعة في دراجة حرارية. 30 دقيقة كافية لصنع منتج يحتوي على 500 نيوكليوتيدات. بعد ذلك ، أضف ميكرولترا واحدا من أربعة هيدروكسيد صوديوم مولار إليه ، واخلطه جيدا بواسطة ماصة ، واحتضانه عند 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق لتحلل الحمض النووي الريبي ، وإطلاق TGIRT من الحمض النووي التكميلي.

باستخدام نهج قائم على العمود لإزالة البادئات ، قم بتنظيف الحمض النووي التكميلي. وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيمه. تحقق من نجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق تشغيل ميكرولترين من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الأغاروز قبل المتابعة إلى إعداد المكتبة.

ثم حدد كمية الأجزاء المستخرجة باستخدام مقياس الطيف الضوئي قبل فهرسة الأجزاء للتسلسل. نقل الخلايا المصابة بالفيروس التي نمت إلى المرحلة المرغوبة من العدوى إلى غطاء دخان مخصص ومناسب يتمتع بمستوى السلامة البيولوجية المطلوب. أضف 2.5٪ من حجم DMS إلى وسط الاستزراع الذي يحتوي على الخلايا ، وأغلق الحاوية بالبارافيلم.

احتضان الحاوية على الفور عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، ماصة بعناية وتخلص من الوسط المحتوي على DMS في النفايات الكيميائية المناسبة. ثم أضف برفق 10 ملليلتر من المخزن المؤقت المؤقت إلى الخلايا ، وكشط الخلايا ، ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر.

بيليه أسفل الخلايا عن طريق طرد الأنبوب لمدة ثلاث دقائق في 3،000 غرام. إزالة الطافي ، وغسل بيليه الخلية مرتين مع 10 ملليلتر من PBS. قم بإزالة PBS المتبقي بعناية قدر الإمكان بعد الغسيل.

قم بإذابة الحبيبات بكمية مناسبة من كاشف عزل الحمض النووي الريبي لإجراء استخراج الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى ملليلتر واحد من الخلايا المتجانسة في كاشف عزل الحمض النووي الريبي ، وقم بتدويره لمدة 15 إلى 20 ثانية حتى يتحول محلول الخلية إلى اللون الوردي الفاتح. انتظر حتى يحدث فصل الطور ، وهو ما يشار إليه بمرحلة الدهون الوردية التي تستقر في الأسفل.

أدر الأنبوب بسرعة حوالي 20،000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية قبل نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد. تنظيف الحمض النووي الريبي وتذوب في كمية كافية من المياه الخالية من النيوكلياز. ثم بعد إجراء استنفاد الحمض النووي الريبوسومي باستخدام النهج المفضل ، قم بتخفيف الحمض النووي الريبي في حجم مناسب من الماء الخالي من النيوكلياز ، وقم بتحديده باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

يمكن استخدام الحمض النووي الريبي المنقى مرة أخرى في RT-PCR. باستخدام خادم الويب المذكور ، يمكن تحليل بيانات DMS-MaP بسهولة. يتم تعيين القراءات إلى مرجع ، ويتم حساب الطفرات لكل قاعدة.

يمكن استخدام ملفات متوسط السكان الناتجة كقيود في برنامج التنبؤ ببنية الحمض النووي الريبي المعروف. يمكن تصور الحد الأدنى من هياكل الطاقة الحرة الناتجة باستخدام برنامج مثل VARNA. اعتبارا من الآن ، فقط الإصدار المستقر من DREAM يمكنه تفكيك مجموعات بنية الحمض النووي الريبي.

ومع ذلك ، فإن العمل على جعل هذه الميزة في متناول المجتمع بأكمله قيد التنفيذ. في النسخ المختبري لجزء gBlock الممدود عن طريق ربط مروج بوليميراز T7 يولد الحمض النووي الريبي محل الاهتمام ، ويظهر كشريط واحد عند 300 نيوكليوتيدات على هلام أغاروز 1٪. تمت الإشارة إلى نجاح RT-PCR الخاص بالجينات الذي تم إجراؤه على الحمض النووي الريبي المعدل DMS بواسطة نطاق واحد عند 300 زوج أساسي على هلام الأغاروز 2٪.

ظهر الجزء المفهرس أعلى بحوالي 150 زوجا أساسيا كما هو متوقع. تم إجراء علاج DMS على خلايا HCT-8 التي تظهر تأثير الاعتلال الخلوي بعد أربعة أيام من الإصابة بالفيروس. ظهر إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج على هلام الأغاروز كشريطين ساطعين ، يمثلان الوحدات الفرعية 40S و 60S.

بعد استنفاد الحمض النووي الريبوسومي ، اختفى الشريطان الساطعان ، تاركين مسحة في الممر المقابل. بعد إعداد المكتبة ، كان للعينات توزيعات متفاوتة الحجم وظهرت كمسحة. تم استئصال النطاق بين 200 و 500 نيوكليوتيد ، وتم فصل ثنائيات المحول.

أظهر نموذج هيكل جينوم SARS-CoV-2 أن القواعد ذات التشكل المفتوح لها تفاعل أعلى مقارنة بتلك المشاركة في إقران القواعد. وأشار موجز بيانات التفاعل للقواعد إلى أن اليوراسيل والجوانين لهما قيم تفاعلية منخفضة ولم يتم تعديلهما بواسطة نظام إدارة الوجهات السياحية. من خلال طريقتنا ، نحن قادرون على التنبؤ بالهياكل في الخلايا بطريقة عالية الإنتاجية دون قيود على الحجم.

تعد مقاييس التحكم مهمة للغاية ، لأنها توفر نظرة ثاقبة لدقة تنبؤات الهيكل. لمزيد من التحقق من دقة التنبؤ ، يجب إجراء المزيد من التجارب التي تزعج أو تغير الهيكل.