الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

الجيل التالي التسلسل (خ ع) هو أداة قوية لتوصيف الجينوم محدود بنسبة الخطأ عالية من النظام الأساسي (~0.5–2.0%). يصف لنا أساليب عملنا لتصحيح خطأ في تسلسل التي تسمح لنا بتفادي نسبة الخطأ خ ع والكشف عن الطفرات في اليل البديل الكسور نادرة ك 0.0001.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مختلف مجالات البحث ، مثل الكشف عن المستنسخة محتملة التسرطن ، والتقييم التنبؤي لمرضى سرطان الدم بعد العلاج ، وتحديد الطفرات المسببة للأمراض المحتملة في المتبرعين بنخاع العظام. سيظهر هذا الإجراء معي هو سبنسر ، وهو فني في المختبر. يصف هذا الفيديو كيفية الجمع بين بروتوكول التسلسل المصحح للخطأ مع كيمياء Illumina ولوحات الجينات المتوفرة تجاريا للكشف عن متغيرات النوكليوتيدات المفردة النسيلة و indels الصغيرة عند حساسية واحدة من كل 10،000.

لدمج المعرفات الجزيئية الفريدة المطلوبة ، تستخدم محولات 16N i5 و i7 المخصصة PCR. أولا ، قم بإعداد Q5 Master Mix ، الذي يستخدم بوليميراز بدقة أعلى من البديل المتاح تجاريا. بعد ذلك ، لكل تفاعل ، اجمع بين 37.5 ميكرولتر من Q5 Master Mix ، وستة ميكرولترات من خمسة محولات ميكرومولار 16N i5 ، وهي المعرفات الجزيئية الفريدة ، وستة ميكرولترات من محولات i7.

إذا كان الهدف هو تعدد الإرسال ، فاستخدم محولات i7 مختلفة في عينات منفصلة. الآن ، قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام المعلمات التالية: ثلاثون ثانية عند 98 درجة مئوية ، تليها أربع إلى ست دورات من عشر ثوان عند 98 درجة مئوية ، وثلاثون ثانية عند 66 درجة مئوية ، وثلاثون ثانية عند 72 درجة مئوية. قم بإنهاء التفاعل بتمديد دقيقتين عند 72 درجة مئوية واستمر عند أربع درجات مئوية.

ثم تعتمد كلتا دورتي تفاعل البوليميراز المتسلسل التي يتعين عليك القيام بها على الأرجح على حجم لوحة الجينات التي تستخدمها ، من تجربتنا ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل رباعي الدورات كاف إذا كانت لوحة الجينات تحتوي على حوالي 1500 مسار مختلف من أوليغوس خاص بالجينات ، في حين أن اللوحة التي تحتوي على حوالي خمسة إلى 600 زوج من أوليغوس تتطلب حوالي ست دورات من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد ذلك ، قم بتنظيف تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الخرز المغناطيسي ، وأضف 56.25 ميكرولتر من محلول الخرزة المغناطيسية إلى كل منتج PCR سعة 75 ميكرولتر ، ثم انقل كل تفاعل إلى أنبوب منفصل منخفض الارتباط سعة 1.5 مليلتر ، يخلط عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عشر مرات على الأقل ، وانتظر خمس دقائق. بعد ذلك ، انقل الخلطات إلى حامل مغناطيسي ، واترك المواد الطافية تختفي لمدة دقيقتين.

ثم قم بإزالة المواد الطفية والتخلص منها. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول ، وانتظر ثلاثين ثانية ، ثم قم بإزالة الإيثانول. كرر خطوة غسل الإيثانول هذه مرة واحدة ، ثم اترك الخرزات تجف في الهواء لمدة خمس دقائق.

أخيرا ، قم بمسح المكتبات المعدلة من الخرز في عشرين ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج. بعد ذلك ، ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لفصل الخرزات المغناطيسية عن المزيح. أولا ، قم بعمل تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف لمكتبات ECS من الخطوة السابقة ، وصولا إلى جزء واحد لكل 1 ، 000 في شرائط PCR.

بعد ذلك ، قم بإعداد Master Mix في أنبوب سعة 1.5 مل. لكل تفاعل ، امزج 10 ميكرولتر من ddPCR EvaGreen Mix ، و 0.2 ميكرولتر من برايمر P5 ، و 0.2 ميكرولتر من برايمر P7 ، و 4.6 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. بعد ذلك ، قم بتقطيع 15 ميكرولترا من EvaGreen Master Mix في مجموعة جديدة من الأنابيب ، وأخيرا أضف خمسة ميكرولتر من واحد إلى 1 ، 000 ECS تم تنظيفه إلى Master Mix.

بعد ذلك ، اصنع قطرات PCR باستخدام مولد القطرات. أولا ، قم بتحميل الكاسيت ، وأنبوب 70 ميكرولترا من زيت توليد القطرات في بئر الكاسيت ، والزيت المسمى ، وأنبوب 20 ميكرولترا من خليط تفاعل ddPCR في العينة المسماة جيدا. بعد ذلك ، قم بتغطية الكاسيت بحشية مطاطية ، وقم بتحميله في مولد القطرات ، وكل توليد القطرات للمضي قدما.

الآن ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، ببطء ، على مدى خمس ثوان ، قم بتحميل 45 ميكرولترا من القطرات المأخوذة من كل بئر كاسيت ، على لوحة PCR جديدة. ثم أغلق لوحة PCR بورق الألمنيوم. الآن ، قم بتضخيم الإشارة في القطرات باستخدام الشروط التالية: خمس دقائق عند 95 درجة مئوية ، تليها 40 دورة من ثلاثين ثانية عند 95 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 63 درجة مئوية ، ثم قم بتبريد التفاعل إلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق قبل رفعه إلى 90 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم عقد عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، قم بإعداد آلة قارئ قطرات قالب ddPCR. حدد المعلمات للقياس الكمي المطلق ، واستخدام QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. ثم قم بتشغيل التفاعلات من خلال قارئ القطرات.

عند اكتمال تحليل ddPCR ، قم بتطبيق نفس العتبات المثيرة للانقسام على كل عينة. بعد ذلك ، قم بتطبيع كل مكتبة إلى العدد المطلوب من الجزيئات. ابدأ بعمل تفاعلات 50 ميكرولتر ، تتكون من 25 ميكرولترا من Q5 Master Mix ، وميكرولترين من برايمر P5 ميكرومولار واحد ، وميكرولترين من برايمر P7 ميكرومولار واحد ، و 21 ميكرولترا من مكتبة الحمض النووي الطبيعية.

بعد ذلك ، قم بتشغيل PCR باستخدام المعلمات التالية: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، تليها 16 دورة من 10 ثوان عند 98 درجة مئوية ، وثلاثين ثانية عند 66 درجة مئوية ، وثلاثين ثانية عند 72 درجة مئوية ، ثم دقيقتين عند 72 درجة مئوية ، واستمر عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، حدد تركيز الحمض النووي في المكتبات ، وقم بتجميع المكتبات بكميات مولية متساوية للتسلسل ، واستهدف ما يقرب من أربعة نانو ضرس. الآن ، قم بتسلسل مكتبة ECS المجمعة باستخدام منصة تسلسل Illumina ، مع إعدادات التسلسل التالية: مرتين 144 قراءة مزدوجة ، وثماني دورات من الفهرس الأول ، و 16 دورة من الفهرس الثاني.

تخفيف الحمض النووي لمريض مصاب بطفرة في GATA1 في الحمض النووي الجيني التجاري في VAF الأصلي البالغ 0.19. باستخدام البروتوكول الموصوف ، أثبت ECS أنه كمي إلى مستوى واحد إلى 10،000 لمتغير النوكليوتيدات الفردية. بعد ذلك ، تم تحليل عينات معطف بافي من عشرين فردا يتمتعون بصحة جيدة باستخدام لوحة تسلسل تجارية تتكون من 568 مكبر.

باختصار ، كانت هناك 109 طفرات جسدية نسيلة موجودة في كلا التكرارين لنقطة زمنية واحدة على الأقل للتجميع مع كسور أليل متغيرة تتراوح من 0.0003 إلى 0.1451.21 من الطفرات ذات التمثيلات الكونية المعروفة وتم التحقق من صحة كل منها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي للقطرات. لإثبات مستوى التعبير المصحح للخطأ في البروتوكول ، تم استخدام لوحة جينية مخصصة تتكون من 415 جينا معروفا بأنها مرتبطة بأنواع مختلفة من السرطان ، لإنتاج مكتبة مبنية من الإكسون الأكثر شيوعا لكل جين. كان مستوى التعبير عن النسخة منخفضة الوفرة قابلا للتكرار بدرجة كبيرة بين التكرارات.

ثم تم استخدام PCR القطرات الرقمية للتحقق من صحة ستة جينات مختارة بتعبيرات مختلفة. تظهر المقارنة أن مستوى التعبير عن الجينات قد تم التقاطه بشكل صحيح بواسطة بروتوكول ECS ، دون الحاجة إلى التطبيع. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بهذه التقنية بشكل مريح في يوم ونصف.

سيكون الجزء الأكبر من الوقت هو الحضانة ، وتستغرق المناولة اليدوية حوالي 30-40٪ من إجمالي الوقت المطلوب ، اعتمادا على عدد العينات التي يعالجها الباحثون في نفس الوقت. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا أن يكون لديك مكتبة تسلسل مكررة لنفس العينة. سيمنحك هذا مزيدا من الثقة في أن الطفرات منخفضة التردد إيجابية حقيقية إذا كانت الطفرة نفسها أساسية بشكل مستقل في كلا التكرارين.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء أمور أخرى مثل ECS RNA من أجل الإجابة على أسئلة مثل الكشف عن نسخة منخفضة الوفرة أو نسخة الاندماج. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في المقام الأول في مجال الأورام الخبيثة الدموية ، ونستخدم هذه التقنية لاستكشاف استنساخ ما قبل سرطان الدم لدى الأفراد الأصحاء وكذلك للكشف عن الحد الأدنى من الأمراض المتبقية في مرضى سرطان الدم الذين هم في مغفرة.