نهجاً الطفرات تشبع رواية: وصف خطوة مفردة بروتين تنظيمي ملزم مواقع في الجيش الملكي النيبالي باستخدام فوسفوروثيواتيس

الهدف العام من نهج الفوسفوروثيوات هذا في الحمض النووي الريبي هو إجراء طفرات التشبع في خطوة واحدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الجزيئية مثل تنظيم الجينات. الفائدة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه في خطوة واحدة يمكن للمرء أن يحقق طفرات التشبع لموقع ربط البروتين في الحمض النووي الريبي.

تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية في بروتوكول طفرات التشبع أحادية الخطوة في تخدير قالب الحمض النووي بالنيوكليوتيدات غير البرية داخل موقع ربط البروتين. قم أولا بتصنيع برايمر T7 عن طريق التخليق الكيميائي على مركب الحمض النووي. بعد ذلك ، قم بتجميع قليل النوكليوتيد المخدر المقابل لموقع ربط البروتين.

في هذا المثال ، يحتوي التسلسل المسطر على مكمل عكسي لموقع ربط البروتين القاتل للجنس ذبابة الفاكهة ، مع تمثيل كل موقع منشطات ب X.استخدم نسبة 90٪ من النيوكليوتيدات من النوع البري إلى 10٪ من النيوكليوتيدات غير البرية لكل موقع من المنشطات. التسلسل باللون الأخضر مكمل لتسلسل التمهيدي T7 وهو محفز T7 للنسخ في المختبر. الخطوة التالية في هذا البروتوكول هي تخليق الحمض النووي الريبي المنفصل مع كل نيوكليوتيد فوسفوروثيوات متبوعا بوضع العلامات الإشعاعية ذات 5 أطراف أولية للحمض النووي الريبي.

قم بتجميع الحمض النووي الريبي لكل فوسفوروثيوات في تفاعل نسخ سعة 20 ميكرولتر. إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق ، أضف ما يلي: مخزن مؤقت للنسخ T7 ، قليل النوكليوتيد T7 ميكرومولار ، قليل النوكليوتيد المخدر ميكرومولار ، 10 ملليمولار DTT ، ملليمولار GTP ، مللي مولار واحد لكل من ATP ، CTP ، و UTP ، ووحدتان لكل ميكرولتر من بوليميراز T7 RNA. أضف 0.167 مللي مولار من alpha-thio ATP إلى أنبوب واحد و 0.05 مللي مولار من alpha-thio UTP إلى الأنبوب الآخر.

احتضان مخاليط تفاعل تخليق الحمض النووي الريبي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، أضف 2.5 ميكرولتر من فوسفاتيز ألفا المتقلب بالحرارة و 2.5 ميكرولتر من محلول الفوسفاتيز 10X إلى كل عينة من الحمض النووي الريبي. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 30 دقيقة لإزالة 5 فوسفات رئيسي.

قم بتعطيل إنزيم الفوسفاتيز القلوي عن طريق التسخين عند 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. تتضمن الخطوات المتبقية استخدام النشاط الإشعاعي ويجب إجراؤها باستخدام الاحتياطات المناسبة ودرع زجاجي للحماية من النشاط الإشعاعي. لتسمية راديوية للطرف المكون من 5 أوائم للحمض النووي الريبي منزوع الفسفرة ، استخدم ميكرولتر واحد من T4 عديد النوكليوتيدات كيناز وميكرولتر واحد من Gamma P32 ATP في حجم تفاعل 10 ميكرولتر.

احتضان خلطات التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. قم بتعطيل إنزيم كيناز بولي النوكليوتيدات T4 عن طريق التسخين عند 65 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. قم بتشغيل التفاعلات في هلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة بنسبة 10٪.

حدد موقع الحمض النووي الريبي على الجل عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي واستئصال شريحة الهلام التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المسمى بالإشعاع. سحق شريحة الجل في أنبوب طرد مركزي دقيق عن طريق الضغط عليها على الجانب بطرف ماصة، ثم أضف محلول البروتيناز K. قم بتدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة من ساعتين إلى ليلة وضحاها.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لملاط الهلام ، واجمع المحلول العازل ، وتخلص من الجل. استخرج كل محلول مرتين بكمية متساوية من كلوروفورم الفينول. بعد ذلك ، استخرج المحلول مرة واحدة باستخدام الكلوروفورم.

اجمع الطور المائي وأضف إليها 0.1 حجم من أسيتات الصوديوم ثلاثية المولار درجة الحموضة 5.2 ، الحمض النووي الريبي الناقل أو الجليكوجين ، و 2.5 حجم من الإيثانول. احتفظ بالعينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة. الطرد المركزي العينات في جهاز طرد مركزي دقيق عالي السرعة عند 16 ، 873 مرة جم لمدة خمس إلى 10 دقائق.

قم بإزالة محلول الإيثانول العازل بعناية دون إزعاج حبيبات الحمض النووي الريبي. اغسل الكريات بنسبة 70٪ من الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. قم بإزالة الإيثانول بعناية وجفف الكريات في الهواء.

أعد تعليق كل حبيبات في 20 إلى 50 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC. يحفظ على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. يتم توضيح مفهوم التقسيم بسبب التداخل هنا.

أثناء عملية ربط البروتين ، تنقسم جزيئات الحمض النووي الريبي بين الجزء المرتبط بالبروتين والجزء غير المرتبط. إذا تداخل نيوكليوتيدات معينة في موضع معين مع ارتباط البروتين ، استبعاده بشكل تفضيلي من الجزء المرتبط بالبروتين. بعد ذلك ، يتم استخدام اليود لشق الحمض النووي الريبي في مواقع دمج الفوسفوروثيوات.

لبدء هذه الإجراءات ، قم بإعداد تفاعلات ربط البروتين والحمض النووي الريبي مع كل تفاعل يحتوي على 10 ملليمولار Tris-HCl ، و DTT واحد مليمولار ، و 50 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم ، و 0.5 وحدة لكل ميكرولتر من مثبط RNase ، و 0.09 ميكروغرام لكل ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار الأسيتيل ، و EDTA واحد ، و 0.15 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ، و 5 ملليمولار من الحمض النووي الريبي المسمى بالإشعاع ، وستة ميكرولتر من التركيز المناسب للبروتين. احتضان تفاعلات ربط البروتين عند 25 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. افصل جزء الحمض النووي الريبي المرتبط بالبروتين عن الجزء غير المرتبط ب الكسر عن طريق ربط مرشح النيتروسليلوز.

ضع تفاعل الربط على مرشح النيتروسليلوز المتصل بمشعب فراغ في درجة حرارة الغرفة. سيتم الاحتفاظ بمركب بروتين الحمض النووي الريبي فقط على المرشح بينما يتدفق الحمض النووي الريبي غير المرتبط عبر المرشح. قم بقص جزء مرشح النيتروسليلوز الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي المشع المحتفظ به إلى قطع أصغر لتلائم أنبوب الطرد المركزي الدقيق وأضف ما يكفي من البروتيناز K المخزن المؤقت لغمر قطع المرشح.

قم بإزالة الحمض النووي الريبي من قطع المرشح لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، انقل المحلول من كل أنبوب إلى أنبوب جديد واستخرجه باستخدام الفينول كلوروفورم والكلوروفورم كما هو موضح سابقا. اجمع المرحلة المائية وأضف إليها 0.1 حجم من أسيتات الصوديوم ثلاثية المولار ، ودرجة الحموضة 5.2 و 2.5 حجم من الإيثانول واحتضانها في الثلاجة.

بعد الطرد المركزي وغسل وتجفيف الحمض النووي الريبي كما هو موضح سابقا ، أعد تعليق الحمض النووي الريبي في المياه المعالجة ب DEPC. يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على اليود في غطاء العادم. لشق الحمض النووي الريبي في مواقع دمج الفوسفوروثيوات ، أضف إلى كل عينة من الحمض النووي الريبي واحدا ملليمولر اليود في 20 ميكرولترا من المياه المعالجة DEPC التي تحتوي على ما يصل إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الناقل.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بترسيب الحمض النووي الريبي المشقوق عن طريق إضافة أسيتات الصوديوم والإيثانول كما هو موضح سابقا. أعد تعليق الحمض النووي الريبي المشقوق في صبغة تحميل لتغيير طبيعة المواد الهلامية.

بعد التسخين ، قم بتحميل العينات في هلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة بنسبة 15-20٪ وافصل شظايا الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي. قم بتعريض هلام بولي أكريلاميد لفيلم الأشعة السينية واكتشف العصابات في الجزء المرتبط مقابل التجمع الكلي باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي. يوضح هذا التخطيطي مفهوم التقسيم بسبب التداخل.

في الممر T ، يكون إجمالي جزء الحمض النووي الريبي ، شدة النطاق متساوية تقريبا لجميع المواضع المخدرة. في جزء الحمض النووي الريبي المرتبط بالبروتين ، في المواضع 1 و 4 و 7 ، ليس للنيوكليوتيدات أي تأثير على الارتباط. ومع ذلك ، في الموضعين 3 و 6 ، فإنه يتداخل مع الربط ويتم استبعاده من الكسر المقيد.

في الموضع 5 ، يكون التداخل جزئيا. تسمح مقارنات الممرات المزدوجة لكل نيوكليوتيدات بتحليل جميع النيوكليوتيدات الأربعة. يظهر هذا التصوير الشعاعي زوجين من الممرات من هلام تغيير الطبيعة.

Lane T هو إجمالي الحمض النووي الريبي والممر B هو الحمض النووي الريبي المرتبط بالبروتين. يشير الخط العمودي إلى موقع الربط المميت للجنس. بالنسبة لزوج ألفا ثيو ألين ، توجد النطاقات 1 و 2 و 3 و 5 في جزء الحمض النووي الريبي الكلي ولكنها غائبة أو مخفضة بشكل كبير في جزء الحمض النووي الريبي المرتبط.

بالنسبة لزوج ألفا ثيو أولين ، يكون النطاقان 7 و 8 أقل كثافة نسبيا في الكسر المرتبط. تعتبر المخلفات التي يتم استبعادها بشكل تفضيلي من الجزء المرتبط مهمة لربط البروتين. بمجرد تصنيع الحمض النووي الريبي وتسمية 5 نهايات أولية ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 12 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن المستوى المناسب من دمج الفوسفوروثيوات وتحديد تركيز البروتين المناسب للربط من الاعتبارات المهمة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل المقايسات الوظيفية المناسبة أو الاختبارات في الجسم الحي للتحقق من صحة نتيجة نهج الطفرات وفهم الأهمية البيولوجية. توفر هذه التقنية بديلا للطرق الأخرى التي تكون إما أكثر تكلفة أو أكثر شاقة أو كليهما.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وتوليف مكتبة متحولة ، وإجراء تفاعلات ربط ، وتحديد النيوكليوتيدات الطافرة في كل تجمع ، والتحليل الكمي لتأثير النيوكليوتيدات من النوع غير البري في كل موضع تم اختباره. لا تنس أن العمل مع بولي أكريلاميد والنشاط الإشعاعي يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل استخدام القفازات والعادم المناسب والدروع المشعة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.