استخدام R و Seurat و CellChat لتحليل مجموعة بيانات النسخ أحادية الخلية لالتئام جروح جلد الفأر

في مختبرنا ، نستخدم الأدوات الناشئة مثل علم النسخ أحادي الخلية والمكاني مع بيولوجيا الأنظمة ومناهج المعلوماتية الحيوية للتحقيق في الديناميكيات الخلوية الزمنية المكانية لنتائج الشفاء التفاضلي. في السنوات الأخيرة ، شهدنا اعتمادا سريعا لنسخ الخلية المفردة لدراسة التئام الجروح لدى البشر والكائنات الحية النموذجية ، مثل الفئران. يعد التحليل الكامل لمجموعات البيانات أحادية الخلية باهظا بالنسبة للعلماء الذين لديهم خبرة قليلة أو معدومة في المعلوماتية الحيوية. هذا يعني أنه في كثير من الأحيان ، يتم استخدام مجموعات البيانات أحادية الخلية بشكل كاف من قبل العلماء في مجال التئام الجروح. هذا هو أول بروتوكول شامل لا يفترض أي خبرة سابقة في المعلوماتية الحيوية ، والتي تأخذ المستخدم على طول الطريق من تنزيل مجموعة البيانات إلى إخراج التحليلات ذات الصلة في سياق أبحاث التئام الجروح. يجب أن يكون بروتوكولنا بمثابة نموذج للباحثين في التئام الجروح لتحليل مجموعات البيانات أحادية الخلية الخاصة بهم بشكل كامل وأن يكونوا قادرين على استخراج رؤى جديدة من مجموعات البيانات المتاحة للجمهور.

[شالين] للبدء ، انتقل إلى ملفات مجموعة البيانات من مستودع الرمز الشامل للتعبير الجيني باستخدام رقم الانضمام GSE204777. انقر فوق مجموعة البيانات الأولى بعنوان GSM6190913. قم بالتمرير إلى أسفل صفحة GSM6190913 وقم بتنزيل الملفات الثلاثة المدرجة باستخدام روابط FTP أو HTML. باستخدام مستكشف ملفات الكمبيوتر ، انقل الملفات التي تم تنزيلها إلى دليل باسم b1 ، مع التأكد من وجودها داخل دليل العمل. استرجع معلومات مسار الدليل لملفات التسلسل أحادية الخلية التي تم تنزيلها. الآن ، قم بتحميل ملفات التسلسل أحادية الخلية في بيئة العمل. بعد ذلك ، افصل التعبير الجيني وتعدد إرسال بيانات HTO عن مجموعة بيانات العمل. قم بإنشاء كائن Seurat باستخدام بيانات التعبير الجيني أثناء تصفية الجينات المكتشفة في أقل من خمس خلايا وخلايا تحتوي على أقل من 200 جين. بالنسبة لمجموعات البيانات التي تفتقر إلى بيانات HTO ، قم بإنشاء كائن Seurat بنفس معلمات التصفية ، وقم بالتبديل إلى مقايسة التعبير الجيني. احسب النسبة المئوية لجين الميتوكوندريا في كل خلية وقم بتعيين هذه القيمة كمتغير بيانات وصفية. تصور توزيع عدد الجينات ، إجمالي الحمض النووي الريبي ، ونسبة جينات الميتوكوندريا عبر جميع الخلايا. قم بإزالة الخلايا التي يتجاوز محتوى الميتوكوندريا 25٪ باستخدام عتبة وتصور التوزيعات المحدثة بعد تصفية هذه الخلايا منخفضة الجودة. اكتشف الدوائيات المحتملة باستخدام طريقة البحث عن SC doublet. قم بتشغيل مسار SC doublet finder باستخدام الأوامر وقم بتعيين درجات الثنائية الناتجة كمتغير بيانات تعريف جديد. الآن ، تصور توزيع الدرجات المزدوجة عبر جميع الخلايا. قم بإزالة جميع الخلايا ذات الدرجات المزدوجة أعلى من 0.25 واحفظ كائن Seurat الذي تم تنظيفه كملف RDS في دليل العمل. إجراء تسوية البيانات وتوسيع نطاقها وتحليل المكونات الرئيسية. تصور مساهمة التباين عبر أول 50 مكونا أساسيا. قم بتجميع الخلايا باستخدام أول 13 مكونا أساسيا ودقة تجميع تبلغ 0.1. قم بإجراء تقريب وإسقاط مشعب موحد ، أو تقليل UMAP في تحليل الجيران ، باستخدام أول 13 مكونا أساسيا واضبط رقم البذور على 123. الآن ، تصور تجميع الخلايا على مخطط UMAP ، متبوعا بالتعليقات التوضيحية لوقت الجرح والمكان على مخطط UMAP. بعد ذلك ، قم بإنشاء جدول يربط مجموعات الخلايا بالتعليقات التوضيحية لوقت الجرح والمكان. حدد هويات نوع الخلية الرئيسية بعد حساب الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي بين جميع المجموعات وقم بتعيين قوائم DEG الناتجة إلى متغير قبل حفظها كملف نصي محدد في دليل العمل. الآن ، افتح ملف علامات مجموعة مجموعة البيانات في تطبيق جدول بيانات. استخدم معالج استيراد النص لتعيين الفاصلة كمحدد وتنسيق أعمدة اسم الجينات كنص لمنع التحويل التلقائي لأسماء الجينات إلى تواريخ. في جدول بيانات، قم بترتيب عمود السجل المتوسط اثنين من القاعدة التشغيلية من الأكبر إلى الأصغر لترتيب الصفوف عن طريق تقليل قيم التغيير المزدوجة للسجل، متبوعا بعمود نظام المجموعة من الأصغر إلى الأكبر. لترتيب الصفوف عن طريق زيادة أرقام مجموعة Seurat ، قم بتصفية عمودي سجل المتوسط اثنين من FC لتضمين قيم أكبر من أو تساوي 2.5 فقط ، ثم قم بتصفية عمود معاهدة التعاون بشأن البراءات 1 لتضمين قيم أكبر من أو تساوي 0.4. بعد ذلك، قم بتصفية عمود معاهدة التعاون بشأن البراءات 2 لتضمين قيم أقل من 0.2 أو تساويها. أخيرا ، قم بتصفية العمود المعدل P-value لتضمين قيم أقل من أو تساوي 0.01. الآن ، افتح أداة تحليل الإثراء المستندة إلى الويب Enrichr. لكل مجموعة ، انسخ قائمة الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي إلى نافذة Enrichr منفصلة وانقر فوق تحليل. بعد ذلك، انقر فوق علامة التبويب أنواع الخلايا أعلى مخرجات التحليل وركز على أهم خمسة إثراء ضمن قواعد بيانات علامات الخلايا الثلاثة المنسقة. استنادا إلى أهم عمليات الإثراء من تحليل Enrichr، قم بتعيين الهويات المحتملة للمجموعات الثمانية. اجمع بين المجموعتين اثنين وستة في تعليق توضيحي واحد يسمى الخلايا الليفية ، وقم بتعيين هذه التعليقات التوضيحية كمتغير بيانات تعريف جديد يسمى أنواع الخلايا. بعد ذلك ، تصور أنواع الخلايا المشروحة على مخطط UMAP واعرض توطين جينات علامات الكتلة العلوية الغامقة على سلسلة من مخططات UMAP. تصور الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي لعلامة الكتلة العلوية على مخطط نقطي مجمعة حسب أرقام المجموعات الأصلية ، ثم جينات العلامة العلوية مرة أخرى في مخطط نقطي ، هذه المرة مجمعة حسب أنواع الخلايا المشروحة. للتحضير لتحليل السلاسل الزمنية، قم بإزالة التعليقات التوضيحية المكانية وتبسيط مجموعة البيانات. أعد تعيين البيانات الوصفية لوقت الجرح والمكان إلى متغير جديد يسمى DPW لأيام ما بعد الجرح. تصور مجموعات الدورات الزمنية الجديدة ل DPW على مخطط UMAP وقم بإنشاء جداول توضح عدد الخلايا من كل نوع داخل كل مجموعة DPW. بعد ذلك ، قم بتحويل عدد الخلايا إلى نسب لتقييم التغيرات النسبية في تكوين نوع الخلية أثناء الشفاء وتصور نسبة كل فئة من فئات DPW داخل كل نوع خلية. أخيرا ، تصور نسبة كل نوع خلية داخل كل مجموعة DPW واحفظ كائن Seurat النهائي الذي يحتوي على جميع التعليقات التوضيحية والمرشحات كملف RDS في دليل العمل. تجمعت جميع الخلايا في مجموعة البيانات بشكل واضح في أنواع الخلايا الرئيسية المرمزة بالألوان على مخطط UMAP ، مما يؤكد التعليق التوضيحي الناجح بناء على توقيعات نوع الخلية المخصبة. تم توطين التعبير العالي عن جينات علامات الكتلة العلوية داخل مجموعات نوع الخلايا الخاصة بها على مخططات UMAP. أكد تصور المخطط النقطي أن أعلى مستويات التعبير لجينات العلامات العنقودية كانت مقتصرة على أنواع الخلايا الرئيسية المشروحة. كشفت مؤامرة الشريط المكدسة أن العدلات والضامة كانت مهيمنة في اليوم الأول بعد الجرح ، بينما أصبحت الخلايا الليفية والخلايا الظهارية والبطانية أكثر انتشارا في نقاط زمنية لاحقة ، مما يعكس الشلال الخلوي المعروف لالتئام الجروح.