تحليلات السكان الخلية خلال الجلد التسرطن

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تحليلات لمجموعات الخلايا في نموذج الفأر لسرطان الخلايا القاعدية لسرطان الجلد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحفيز التعبير الجيني المستهدف أولا في الفئران. في الخطوة الثانية ، يتم عزل البشرة عن جلد الفأر.

بعد توليد معلق خلية واحدة ، يتم تصنيف خلايا البشرة بعلامات خدمة خلوية محددة. في النهاية ، يمكن مراقبة تغيرات خلايا الخلايا أثناء تطور الورم في الجلد عن طريق تحليل التدفق الخلوي. تطور السرطان هو عملية تشمل العديد من أنواع الخلايا.

الهدف من هذا الإجراء هو مساعدة الباحث على التحقيق في كيفية مساهمة الخلايا المختلفة في تطور سرطان الجلد. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للتفاعلات الخلوية أثناء تطور سرطان الجلد ، ولكن يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل سرطان البنكرياس. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه من الصعب تحديد متى يجب إنهاء التجربة دون تقييم بصري.

للبدء ، يشار إلى الفئران من الكيراتين 14 Cree ER باسم الفئران K 14 مع فئران Rosa 26 التي تحتوي على الجين المنعم المتحور SMU M الذي يشار إليه باسم SMU. فئران. بعد ذلك ، اغمر عينات الذيل الطويلة 0.5 سم التي تم حصادها من الفئران الإيجابية المزدوجة التي يبلغ عمرها ثلاثة إلى ستة أسابيع في محلول تحلل ذيل تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر مع ملليغرام واحد لكل مليلتر من البروتيناز K ، ثم احتضان العينات بين عشية وضحاها عند 55 درجة مئوية مع الرج. في اليوم التالي ، قم بتدوير الأنسجة بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي صغير لإزالة الحطام.

ثم للتنميط الجيني لكل ، استخدم ميكرولتر واحد من SNAT من كل عينة في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الفردية مع البادئات والظروف على النحو الموصى به من قبل البائع. استخدم إبرة تغذية منحنية عيار 20 لإعطاء تاموكسيفين للحيوانات. إيجابي مزدوج ل K 14 C er ، و ROSA 26 عن طريق التزقيم الفموي لمدة خمسة أيام متتالية للحث على تعبير OO M اثنين في الخلايا الكيراتينية.

بشكل عام ، تكون الأنماط الظاهرية أكثر حدة على الأذن وذيل الفئران GFP الموسومة K 14 OO لحصاد الجلد لتحليل الخلايا. أولا ، استخدم الرعاش لإزالة الفراء من القتل الرحيم. ثم قم بإزالة جلد الفأر واغمر الأنسجة في محلول disbe عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين.

بعد علاج ديسبا ، استخدم زوجا من الملقط لفصل البشرة عن الأدمة. استخدم الآن مقصا لفرم البشرة. ثم اغمر الأنسجة في محلول الكولاجيناز الرابع لمدة ساعة إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية في أنبوب سعة 50 ملليلترا.

بتدوير الأنبوب برفق كل 20 دقيقة لفصل الخلايا. استخدم مجهرا لتأكيد تفكك الخلية عندما يمكن اكتشاف خلايا مفردة في وسط الكولاجيناز. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة إضافية لزيادة إنتاجية الخلية.

ثم قم بتصفية خليط الأنسجة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون وغسل الخلايا لمدة 10 دقائق عند 500 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لتسمية الخلايا تبدأ بإعادة التشكيل ، مع تعليق الحبيبات المغسولة للتو في PBS المكملة بنسبة 10٪ FBS عند 2.5 في 10 من الخلايا الست لكل مليلتر. ثم ضع محلول الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة لمنع أي ارتباط غير محدد. بعد ذلك ، قم بنقل حصة الخلايا إلى أنابيب دقيقة سعة 1.5 ملليلتر لوضع علامات محددة على الأجسام المضادة.

إضافة الأجسام المضادة إلى كل أنبوب بتركيز نهائي قدره ميكروغرام لكل مليلتر. قم بتدوير الأنابيب برفق لعدة ثوان لخلط الأجسام المضادة مع الخلايا ثم ضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد غسل الأنابيب في مليلتر واحد من PBS ، أعد تعليق الكريات في PBS ثم أضف DPI بتركيز نهائي قدره ملليغرام واحد لكل مليلتر.

عند تحليل البيانات ، حدد أولا خلايا مفردة بناء على مخطط التشتت الأمامي مقابل مخطط الانتثار الجانبي ، باستثناء الخلايا الميتة الموجبة ل DABI. لا تصاب الفئران بسرطان الخلايا القاعدية إلا عند تنشيط إشارات القنفذ كما هو موضح في هذه الصور. ينتج عن التعبير الناجم عن تاموكسيفين عن المسرطن الناعم M two YFP النمط الظاهري للجلد الذي يظهر حتى عند المستوى التشريحي للنمو في الجلد h و e العينات الملطخة من هذه.

يمكن ملاحظة أورام الجلد في فئران K 14 SMU. بدون تحريض SMU M اثنين YFP ، لم يظهر جلد مورفولوجيا غير طبيعية بواسطة h و e. يظهر تلطيخ هذه المخططات النقطية تحليلا تمثيليا للخلايا النخاعية في الفئران الطبيعية والحاملة للورم.

يتم اشتقاق الخلايا الإيجابية ل CD 11 B GR من الخلايا النخاعية ، وبعضها عبارة عن خلايا مثبطة مشتقة من النخاع في الفئران الطبيعية وغير smu M التي يسببها YFP. بالكاد يمكن اكتشاف مجموعة الخلايا الإيجابية ل CD 11 B إيجابية GR ، ولكنها تزداد استجابة للالتهاب أو تطور الورم. في K 14 فئران SMU.

يؤدي التعبير المستحث عن smu M two YFP والخلايا الكيراتينية في الجلد إلى زيادة في CD 11 B إيجابي GR واحد مجموعة الخلايا الإيجابية. ستسمح هذه التقنية للباحثين في مجال بيولوجيا الجلد بإجراء التحليل الجزيئي لسرطان الخلايا البائية في الفئران.