سير عمل التصوير والتحليل عالي الإنتاجية لتقييم الأنماط الظاهرية لخلايا الجلد وحالات التكاثر في عينات الأنسجة

يجمع هذا البروتوكول بين طريقة التصوير البصري متعدد الإرسال وتصنيف IBEX و Click-iT EDU لاكتشاف وتصنيف أنواع الخلايا المنقسمة في عمليات ديناميكية للغاية ، مثل إصلاح الجلد. علاوة على ذلك ، نحن نقدم خط أنابيب جديد لمعالجة التصوير مفتوح المصدر للحصول على الصور وتحليلها عالي الإنتاجية. قم بتغطية صفيحة 24 بئرا ب 200 ميكرولتر من جيلاتين الألومنيوم الكروم واحتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة على شاكر هزاز.

ثم قم بإزالة الجيلاتين تماما وجفف الآبار المطلية لمدة 60 دقيقة في فرن 40 درجة. قم بقص الأنسجة المضمنة في OCT بسمك 15 إلى 30 ميكرومتر في التبريد ونقلها بسرعة إلى بئر مطلي يحتوي على ملليلتر من PBS. قم بإزالة PBS بعناية باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد تهدف إلى إبقاء قسم الأنسجة في منتصف البئر.

للقيام بذلك بشكل فعال ، قم بشفط PBS ببطء من حواف البئر ، واضبط موضع الماصة حسب الحاجة لمنع الأنسجة من التحول. جفف أقسام المناديل لمدة ساعة في فرن 37 درجة مئوية. أعد الترطيب بملليلتر واحد PBS لمدة خمس دقائق.

نفل الأنسجة ب 500 ميكرولتر من 0.5٪ تريتون لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل المناديل لفترة وجيزة مرتين باستخدام PBS وقم بإجراء تفاعل Click-iT لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حافظ على العينات محمية من الضوء.

اغسل المناديل لفترة وجيزة مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. قم بحظره لمدة ساعة واحدة باستخدام مخزن مؤقت مانع في درجة حرارة الغرفة. أضف الأجسام المضادة الأولية للدورة الأولى.

واحتضان الطبق طوال الليل عند أربع درجات مئوية. يغسل مع PBS ثلاث مرات. قم بإجراء تلطيخ الأجسام المضادة الثانوي.

بالنسبة للدورة الأولى ، قم بتطبيق الأجسام المضادة الثانوية للأجسام المضادة الأولية غير المقترنة مع صبغة نووية. احتضان العينات المحمية من الضوء لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل المناديل ثلاث مرات بملليلتر واحد لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

اترك حوالي 500 ميكرولتر من PBS في كل بئر وأحضر اللوحة إلى المجهر. في برنامج Meta Express ، انقر فوق الفرز ثم إعداد الاستحواذ. انقر فوق الزر إخراج.

نظف الجزء السفلي من اللوحة بنسبة 70٪ من الإيثانول وأدخل اللوحة في المجهر. انقر فوق الزر تحميل اللوحة. ضمن علامة التبويب الهدف والكاميرا، حدد التكبير المطلوب.

كوضع اكتساب، حدد وضع الشق متحد البؤر 51 ميكرومتر. ضمن علامة التبويب لوحة، حدد طراز اللوحة. انتقل إلى علامة التبويب "زيارة مواقع اللوحات".

ضمن خيارات الموقع ، انقر فوق عدد ثابت من المواقع. اضبط عدد الأعمدة والصفوف بحيث يتم تغطية البئر بأكمله تقريبا. انقر فوق مواقع التداخل 10٪ حدد فقط البئر الأول للاستحواذ بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق البئر المقابل على خريطة اللوحة.

انتقل إلى علامة التبويب التركيز البؤري التلقائي للاكتساب. للتركيز البؤري التلقائي الجيد ، حدد خيار اللوحة وأسفل البئر. بالنسبة للتركيز التلقائي للموقع، حدد خيار جميع المواقع.

انتقل إلى علامة التبويب الأطوال الموجية واختر عدد الأصباغ المراد تصويرها في الدورة الحالية. انتقل إلى علامة التبويب الطول الموجي الأولى. اختر الليزر مع إزاحة Z لتحديد موضع Z، وانقر فوق الزر Calculate Offset لتعيين ارتفاع التصوير الصحيح.

اختر الصورة التي تكون فيها العينة أفضل تركيز. اضغط على زر التركيز البؤري. يتم عرض صورة في التركيز البؤري للأنسجة.

اضبط طاقة الإضاءة على 50٪ اضبط شدة الحد الأقصى المستهدف على 2000 واضغط على التعريض التلقائي. بالنسبة للسلسلة Z ، اختر صورة عرض من السلسلة Z و 2D ، ولتصحيح التظليل ، اختر تظليل FL فقط. كرر الخطوات للأطوال الموجية الأخرى ، ولكن بدلا من الليزر مع إزاحة Z ، اختر Z-offset من W1 واختر صفرا.

انتقل إلى خطوة السلسلة Z وأدخل حجم الخطوة المطلوب. انقر فوق الزر تركيز. اسحب سهم الموضع الحالي حتى يتم الوصول إلى الجزء السفلي من الأنسجة وانقر فوق الزر Set B.

اسحب سهم الموضع إلى أعلى المنديل وانقر فوق الزر تعيين T. انقر فوق F2 ، إيقاف ، اضغط على بدء البث المباشر مرة أخرى. تأكد من أن المرحلة في البئر الأول بالنقر بزر الماوس الأيسر عليها.

ابحث عن حدود الأنسجة وحدد جميع المواقع التي تحتوي على الأنسجة للحصول عليها بالنقر بزر الماوس الأيمن. انتقل إلى علامة التبويب تشغيل واكتب اسم اللوحة. انقر فوق حفظ البروتوكول.

قم بإعداد منطقة الاستحواذ لجميع الآبار الأخرى. قم بتشغيل Control و Journal وابدأ التسجيل ثم Control على الفور ، دفتر اليومية ، إيقاف التسجيل. احفظ دفتر اليومية الذي تم إنشاؤه وافتحه مرة أخرى عبر التحكم ودفتر اليومية وتحرير دفتر اليومية.

في اللوحة اليمنى ، انتقل إلى اكتساب اللوحة ، وقم بتحميل البروتوكول من الملف وانقر فوق اكتساب اللوحة لإضافة هذه الخطوات إلى دفتر اليومية. انقر نقرا مزدوجا فوق تحرير اكتساب اللوحة ، وقم بتحميل البروتوكول من الملف ، واختر البروتوكول المحفوظ للبئر الأول. كرر الخطوات الخاصة بكل بئر سيتم الحصول عليها ، مع التأكد من تحميل البروتوكول المعني دائما.

انقر فوق تشغيل دفتر اليومية لبدء عملية الاستحواذ. قبل 30 دقيقة من نهاية المجلة ، ابدأ في تحضير كاشف التبييض. قم بإذابة 10 ملليغرام من بوروهيدريد الليثيوم في 10 ملليلتر من H2O المقطر المزدوج ومرر عبر مرشح 0.22 ميكرومتر.

اتركيه لمدة 10 دقائق. يجب أن يبدأ الحل في تكوين فقاعات. لضمان التبييض الفعال ، استخدم كاشف التبييض في غضون أربع ساعات بعد التحضير.

أضف محلول التبييض إلى العينات واحتضنه لمدة 15 دقيقة مع إبقاء العينات معرضة للإضاءة المحيطة. يجب أن تظهر فقاعات صغيرة على الأنسجة. اغسل العينات المبيضة ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من PBS لمدة خمس دقائق ، كل منها في درجة حرارة الغرفة.

أضف الأجسام المضادة الأولية للدورة التالية واحتضن طوال الليل عند أربع درجات مئوية. يكشف تصوير IBEX متعدد الإرسال جنبا إلى جنب مع وضع العلامات Click-iT EDU عن هياكل مختلفة وأنواع الخلايا المتكاثرة في الجلد المصاب. يظهر وضع العلامات على EDU على العينات المحفوظة بالتبريد أنه متشابه عند إجراء وضع العلامات على التألق المناعي للأجسام المضادة ل KI-67 على أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين ، بالإضافة إلى وضع العلامات على الخلايا باستخدام KI 67 باستخدام قياس التدفق الخلوي.

يسمح استخدام هذا البروتوكول بالكشف الدقيق عن تكاثر الخلايا في العمليات البيولوجية المعقدة. علاوة على ذلك ، لا يتطلب خط أنابيب معالجة التصوير مفتوح المصدر أي خبرة في البرمجة وينشئ ملفات يمكن معالجتها باستخدام برامج غير تجارية ، مثل فيجي و quPath. علاوة على ذلك ، لا يتطلب هذا البروتوكول أي معدات باهظة الثمن ، وبالتالي ، يمكن إجراؤه في معظم إعدادات البحث.