الطريقة المثلى للزراعة والتكبير الحيوي الميكروبي ل Typha latifolia (Cattail)

يعالج عملنا نقص البروتوكولات لزراعة القطيل من البذور. طورنا طرقا قابلة للتكرار لإنبات البذور، والنمو المبكر، وتعزيز الأحياء الميكروبية لدعم أبحاث الميكروبات النباتية المستقبلية. قليل من الدراسات تزرع الكاتتيل من البذور أو تتبعها حتى النضج، ومع ذلك تستخدم الكاتتيل عادة في أبحاث معالجة الأراضي الرطبة.

معظم أبحاث القطط في التجارب المخبرية تتضمن شراء الجذور لتكاثر القطيل. قليل من الدراسات تزرع الكاتيل من البذور، مما لا يترك طرقا موحدة. كان تحقيق إنبات مستمرة واستعمار مستمر للميكروبات المدخلة تحديا كبيرا.

طورنا طرقا قابلة للتكرار لإنبات البذور وتعزيز الأحياء الميكروبية، مما يوضح كيف يساعد التطعيم المبكر في دعم الاستعمار طويل الأمد. للبدء، استخدم مقصات الحديقة لقطع ساق نبات Typha latifolia على بعد حوالي سنتيمترين من قاعدة الزهرة. اسحب البذور من النورة، وانقل البذرة إلى خلاط مختبر حتى يمتلئ الخلاط تقريبا ربع البنزين، أي حوالي 250 ملليلتر من البذور غير المضغوطة.

الآن املأ الخلاط ب 500 ملليلتر من ماء الصنبور، لضمان الحفاظ على مساحة رأس 10 سنتيمتر. اخلط الخليط بسرعة منخفضة متوسطة لمدة 20 ثانية، وانقل المحتويات اللزجة فورا إلى كأس سعة لتر واحد. انقل حوالي 100 ملليلتر من خليط ماء البذور إلى الخلاط.

ثم أضف 400 إلى 600 ملليلتر من ماء الصنبور الطازج وامزجه بسرعة متوسطة عالية لمدة 20 ثانية. اسكب المحتويات في كأس جديد سعة لتر واحد. الآن املأ الكأس بماء الصنبور حتى 800 ملليتر.

بعد تركه لمدة 60 ثانية، انزع الحمأة العائمة من الأعلى دون إزعاج البذور المستقرة في الأسفل. اسكب الماء المتبقي ببطء وانقل البذور إلى كأس بسعة 100 ملليتر. كرر عملية الخلط لبقية طين ماء البذور. بعد ذلك، ضع الكأس الذي يحتوي على البذور المفصولة على طبق تحريك.

بعد التحريك، قم بإزالة أي مواد نباتية عائمة من سطح الكأس. اسكب البذور في قمع بوشنر مع ورق فلتر مثبت بمكنسة واتركها تجف طوال الليل. خزن البذور المجففة على درجة حرارة 20 درجة مئوية في أنابيب بولي بروبيلين مخروطية بحجم 50 مليليتر.

جهز ألواح موراشيغي وسكوغ نصف القوة مع 1٪ فيتو آجار. انقل حوالي ملليغرام واحد من البذور المجففة إلى أنبوب بولي بروبيلين مخروطي بسعة 15 ملليتر. ثم أضف 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج المعقم إلى الأنبوب.

ضع الأنبوب على هزاز مداري بسرعة متوسطة عالية لمدة 10 دقائق. الآن أزل الماء من الأنبوب وأضف خمسة ملليلتر من محلول بولي سوربات 20 بنسبة 0.1٪ محضر في ماء مقطر مزدوج معقم. اهز الأنبوب بسرعة متوسطة وعالية لمدة 10 دقائق.

أزل محلول بولي سوربات 20. قم بجميع الخطوات التالية أمام غطاء تدفق اللهب أو الطبق. استبدل المحلول بخمسة ملليلتر من محلول 30٪ من المبيض التجاري و0.025٪ بولي سوربات 20 محضر في ماء مقطر مزدوج معقم.

استبدل المادة الفائقة بماء مقطر مزدوج معقم. ثم هز الأنبوب بسرعة متوسطة وعالية لمدة خمس دقائق. بعد الشطف الثالث، قم بتدوير الأنبوب بسرعة منخفضة لمدة 24 ساعة لتحفيز الإنبات.

في اليوم التالي، أزل الماء الزائد وتأكد من بقاء ثلاثة ملليلتر من السائل في الأنبوب. الآن بشكل غير مباشر، اقطع طرف ماصة بلاستيكية بسعة 1000 ميكرولتر. استخدم رأس الماصة المقطوعة لعمل الماصة بقوة وتعليق البذور داخل الطرف.

ضع البذور والسائل على أطباق موراشيغي وسكوغ أجار نصف قوة. حرك الطبق بلطف لتوزيع البذور بشكل متساو. لف الألواح بفيلم ختم مختبري، ثم ضعها في غرفة نمو بدورة ضوء 16 ساعة و8 ساعات مظلمة عند 23 درجة مئوية ورطوبة 70٪.

لتلقيح بذور القطيل، قم بتعقيم البذور باستخدام مبيض متعدد السوربات 20 وماء مقطر مزدوج كما هو موضح. قس الكثافة البصرية لزراعة لوتيموناس المعزولة ليلا عند 600 نانومتر. تطبيع الزراعة إلى قيمة امتصاص 1.0 عن طريق تخفيف الزراعة في وسط الزرعة.

الآن قم بجهاز الطرد المركزي بكمية واحدة من الثقافة عند 9,300 جرام لمدة دقيقتين. أزل المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من PBS. بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الفائقة مرة أخرى، أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في ملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج المعقم.

استخدم بذور معقمة، ثم قم بتخفيف اللقاح بدرجة واحدة إلى عشرة مع محلول خافض أورغانوسيليكوني 0.025٪ في نفس الأنبوب. اهز نظام التعليق بسرعة منخفضة لمدة 24 ساعة قبل إنبات البذور. ابدأ بملء وحدة نمو نبات معقمة بتربة مفضلة مبللة مسبقا بماء الصنبور.

غط رأس قفل Luer بورق الألمنيوم وقم بتعقيم الوحدة على دورة سائلة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، في ظروف معقمة، يتم توصيل وحدة فلتر بحجم 0.2 ميكرومتر بموصل Luer Lock في غرفة النمو. افتح الحجرة وأضف 500 ميكرولتر من الفلتر المعقم بنسبة 1٪ في 20 × 20 إلى التربة.

اخلط التربة بملعقة معقمة مع إضافة ماء مقطر مزدوج معقم للحفاظ على الترطيب دون إفراط تشبع التربة. الآن، استخدم شفرة حلاقة معقمة لقطع موراشيغي وسكوج أجار من صفائح تحتوي على شتلة قديمة ضعيفة إلى أرباع. باستخدام ملعقة معقمة، انقل قطعة أجار واحدة تحتوي على الشتلة إلى التربة المحضرة في غرفة النمو.

انقل وحدة غرفة النمو إلى حاضنة نمو النبات مضبوطة على دورة ضوء 16 ساعة و8 ساعات مظلمة عند 23 درجة مئوية ورطوبة 70٪. أدى التشويش الكامل لبذور تايفا إلى انفصال مكونات البذور بشكل واضح، بينما أدى التشويش غير الكامل إلى ترك المنقار ملتصقا وبقيت البذور غير المشوهة سليمة. لقد ثبت أن النظام المائي المعقم يدعم نمو أنواع الكاتتيل والجونكوس، التي تم تصويرها هنا باسم جونكوس، والتي تم الحفاظ عليها داخل النظام المعقم لمدة تصل إلى عام واحد.

لوحظ أعلى معدل إنبات للبذور بنسبة 20.8٪ باستخدام طريقة 30٪ من التبييض وبولي سوربات 20، والتي كانت أعلى بكثير من جميع علاجات التعقيم الأخرى باستثناء طريقة غاز الكلور لمدة ساعة واحدة التي لم تتمكن من تحقيق تعقيم كامل للبذور. بعد سبعة أيام من الندب، طورت شتلات التيفيا الإنبات جذوريا مرئية وأنسجة براعم في بيئة صفيحة بتري غير معقمة. بعد الزرع في التربة، استقرت مجموعة فرعية من شتلات تايفا بنجاح وأنتجت نسيج براعم جديد خلال أسبوع إلى أسبوعين.

بعد التطعيم بأنواع Luteimonas التي تحمل بلازميد DsRed، لوحظ استعمار بكتيريا فلورية حمراء في جميع جذور شتلة Typha بعد 16 يوما من التطعيم.