نظام الزراعة المائية المشتركة للتحليل المتزامن والمنهجي للتفاعلات الجزيئية النباتية / الميكروبية والتشوير

الهدف العام لهذا النظام هو دراسة تفاعل الإشارات المتبادلة والاستجابات بين الشركاء النباتيين والشركاء الصغار أو استجابات النبات للمواد الكيميائية أو العوامل اللاأحيائية في إعداد تجريبي بسيط يحاكي البيئة الطبيعية عن كثب. يظهر هذا الفيديو الزراعة المشتركة للنباتات مع Agrobacterium tumefaciens bacterium. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في التفاعلات الميكروبية للنباتات ، والاستجابة الميكروبية أو الإجهادية للنباتات ، وفي الإشارات الجزيئية ، بما في ذلك الإشارات المعقدة حتى في المرحلة الأولية من التفاعلات الميكروبية للنبات.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تساعد على فهم إشارات الطبيعة والاستجابة للتفاعلات الميكروبية للنبات ، في إعداد بسيط يتضمن تقليد البيئة الطبيعية. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتوفير نظرة ثاقبة للتفاعلات النباتية مع نوع ميكروبي واحد ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لدراسة تفاعلات النبات مع أنواع ميكروبية متعددة أو مع العوامل اللاأحيائية. كانت لدينا فكرة عن هذه الطريقة أثناء البحث عن توازن إشارات الخلية أثناء تفاعلات ميكروبات النبات التي تحاكي المواقف الطبيعية عن كثب.

لبدء التجربة ، يجب تعقيم البذور. بالنسبة إلى نبات الأرابيدوبسيس الثاليانا، اجمع ما يقرب من 200 بذرة مع 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في أنبوب طرد مركزي صغير، وقم بتدوير الأنبوب بسرعة عالية. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 9000 × جم لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة.

باستخدام ماصة ، قم بإزالة المادة الطافية للماء. بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من هيبوكلوريت الصوديوم 2٪ إلى البذور وقم بدوامها. دع الخليط يستقر في درجة حرارة الغرفة.

بعد دقيقة واحدة ، قم بالطرد المركزي للبذور. باستخدام الماصة ، قم بإزالة محلول هيبوكلوريت الصوديوم. ثم أضف 500 ميكرولتر من الماء المعقم منزوع الأيونات إلى البذور ، وقم بدوامة الخليط.

بعد الطرد المركزي للأنبوب ، قم بإزالة الماء. أضف 500 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول إلى البذور ، وقم بدوامة الخليط. بعد السماح للبذور بالاستقرار لمدة دقيقة واحدة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب.

قم بإزالة الإيثانول بنسبة 70٪ باستخدام ماصة. اغسل البذور خمس مرات ب 500 ميكرولتر من الماء المعقم منزوع الأيونات. بعد ذلك ، أعد تعليق البذور المعقمة في 500 ميكرولتر من الماء المعقم فائق النقاء.

صب 25 مل من نصف قوة Murashige و Skoog ، أو MS المتوسطة مع 04٪ phyto agar في كل طبق بتري معقم وعميق. لكل طبق بتري ، قم بقص شبكة 90 ملم × 90 ملم مربعة من الفولاذ المقاوم للصدأ. ثني زوايا كل شبكة مربعة بما يكفي بحيث تتناسب الشبكة مع لوحة بتري.

قم بثني الزوايا بزاوية 90 درجة إلى الجزء الأكبر من الشبكة للسماح بدعم الشبكة من الزوايا ، مع ترك مساحة كافية أدناه لتطوير الجذر. ضع المربعات الشبكية المقطوعة في دورق وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم. تعقيم المربعات الشبكية عن طريق التعقيم باستخدام دورة جافة مدتها 30 دقيقة.

بمجرد أن يتجمد الوسيط في أطباق بتري ، وتصبح الشبكة معقمة ، ضع كل مربع شبكي فوق الوسط الصلب بحيث تكون الزوايا المنحنية متجهة لأسفل. ادفع الشبكة بحيث تخترق الزوايا الوسط ويلامس الجزء الأكبر من الشبكة السطح العلوي للوسط. بعد ذلك ، استخدم ماصة معقمة سعة 200 ميكرولتر لسحب بذور A thaliana الفردية المعقمة على السطح ونقل كل بذرة برفق فوق الشبكة.

ضع البذور بحيث تكون متباعدة حسب الأنواع النباتية والاحتياجات التجريبية. أغلق أطباق بتري بأغطية وضع شريطا جراحيا مساميا حول حواف الألواح. لف البذور بورق الألمنيوم.

قم بتقسيم البذور إلى طبقات عن طريق وضع طبق بتري بالكامل. بعد يومين ، قم بزراعة البذور في طبق بتري على حرارة 22 إلى 24 درجة مئوية مع فترة تصوير مدتها 16 ساعة لمدة 10 إلى 14 يوما. في غطاء التدفق المعقم ، صب 18 مل من وسط MS السائل المعقم في خزانات زجاجية أسطوانية معقمة بأغطية معقمة.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا معقما لنقل كل مربع شبكي برفق مع شتلات عمرها 10 إلى 14 يوما من طبق بتري من الوسط شبه الصلب إلى خزان أسطواني مائي. الشتلات الموضحة هنا هي البرسيم. أغلق الأغطية على الخزانات باستخدام شريط جراحي مسامي.

ثم قم بزراعة الشتلات على حرارة 22 إلى 24 درجة مئوية مع فترة تصوير مدتها 16 ساعة ورجها عند 50 دورة في الدقيقة. قبل التلقيح ، افحص الخزان بالشتلات بعناية بحثا عن أي تلوث محتمل. يجب أن يكون الوسط الموجود في الخزانات غير الملوثة واضحا وشفافا.

إذا كانت الخزانات غائمة بالتلوث ، فتخلص منها وقم بترقيم باقي الخزانات. عينة 20 ميكرولترا من وسط الزراعة المائية من كل خزان مرقم وقم بتثبيته على طبق بتري مع مرق لوريا أو أجار LB. احتضن الطبق على حرارة 28 درجة مئوية لمدة 28 ساعة.

على الفور بتلقيح كل خزان مائي مرقم ب 50 ميكرولترا من تعليق البكتيريا الزراعية في كل خزان مائي مرقم. شارك في زراعة الشتلات و A بكتيريا tumefacians عند 22 إلى 24 درجة مئوية مع فترة تصوير مدتها 16 ساعة واهتزاز بسرعة 50 دورة في الدقيقة. افحص لوحة LB المرقطة بعد 12 و 28 ساعة من الحضانة للتحقق من عقم وسط النمو المائي.

إذا كان هناك أي تلوث ، فلا تستخدم الخزان المرقم المقابل الملقح بالبكتيريا لمزيد من المقايسات النهائية. بعد ذلك ، افصل الجذور عن التعليق البكتيري عن طريق رفع اللوحة الشبكية. في حالة استخدام الجذور للتحليلات اللاحقة ، قم بقص الجذور ، واشطفها بسرعة بالماء المقطر المزدوج ، وجففها على ورق ترشيح معقم.

في حالة استخدام الأوراق أو الأنسجة الأخرى ، قم بقطع الأنسجة. لتحليل نسخ النبات ، يجب ترسيب الجذور أو البراعم على الفور في النيتروجين السائل. لتحليل النسخ البكتيري ، قم بنقل 1.5 مل من المزرعة من خزان الزراعة المشتركة وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

بعد الزراعة المشتركة المناسبة ، استخدم مقصا معقما لفصل الجذور الثانوية الفردية ، الفروع الجانبية للجذر الرئيسي. بعد ذلك ، اشطف الجذور بالماء المقطر المزدوج لإزالة المواد المربوطة بشكل غير محكم. اغمر كل جذر في 30 ميكرولترا من الماء على شريحة مجهرية ، وقم بتغطيته بقلة غطاء زجاجي.

أغلق حواف الغطاء بطلاء الأظافر لحماية الجذور من الجفاف. ثم تخيل ارتباط A tumefacians بجذور الثاليانا عن طريق الفحص المجهري الفلوري. بعد الزراعة المشتركة المناسبة ، افصل النباتات عن وسط الزراعة المائية.

قم بتعقيم 18 مل من وسط الزراعة المائية عن طريق تمريره عبر مرشح مسام 0.2 ميكرون إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل. قم بتجميد العينات عند 80 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بفك الأغطية الموجودة على الأنابيب المخروطية سعة 50 مليلتر وضعها في آلة التجفيف بالتجميد لمدة 36 ساعة.

أخيرا ، تابع تخزين العينات أو معالجتها لتحليل HPLC والكشف عن المركب. بدون مغذيات مصطنعة ، نما A tumefacians c58 في نظام الزراعة المشتركة. على النقيض من ذلك ، لم يلاحظ أي نمو بكتيري في ثقافة التحكم بدون ثاليانا.

يمكن استخدام أنظمة الزراعة المائية المشتركة لدراسة ارتباط البكتيريا ببنية الجذر كما هو موضح في هذا التصور المجهري ، حيث تم توطين البكتيريا المسماة بالدقيق الأحمر PCherry في بنية جذر النبات بشكل نموذجي يشبه الصخور أو خيوط. يمكن التأكد من ملامح التعبير الجيني لكل من أعمدة النبات والميكروبات المتفاعلة عبر QRTPCR. بعد ثماني ساعات من الزراعة المشتركة ، كشفت ثماني خلايا توميفاسي عن تنظيم التعبير عن جينات الفوعة.

في الوقت نفسه ، كشفت جذور A thaliana عن التعبير الجيني التفاضلي استجابة للزراعة المشتركة. بعد 72 ساعة من الزراعة المشتركة ، تم تعزيز 35 مركبا وتم تقليل 76 مركبا في إفراز النباتات الملقحة مقارنة بالسيطرة. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة تفاعلات النبات والميكروبات واستكشاف الاستجابات المتبادلة بين شركاء النبات والميكروبات أو الميكروبات الأحيائية ، أو استجابات النبات للعوامل اللاأحيائية في إعداد بسيط يحاكي البيئة الطبيعية عن كثب.

بعد مشاهدة هذا معك ، نأمل أن تكون قادرا على إنشاء نظام زراعة ميكروبية نباتية مشتركة في الزراعة المائية لدراسة النباتات الجزيئية والتفاعلات الميكروبية واستجابات الإشارات في بيئة أكثر طبيعية ويمكن التحكم فيها.