تباين الخواص الفلورية الذي تم حله بمرور الوقت من الجزيئات المفردة لتوصيف المرونة المحلية في الجزيئات الحيوية

يهدف هذا البحث إلى دراسة المرونة والديناميكيات المحلية للجزيئات الحيوية على مستوى الجزيء الفردي ، باستخدام تباين الخواص الفلوري الذي تم حله بمرور الوقت في وضع الفحص المجهري متحد البؤر. مكن اكتشاف الجزيء الفردي وتوطينه من مراقبة الجزيئات الحيوية ، ومع ذلك فإن التقاط ديناميكياتها يتطلب مناهج أخرى. تساعد طرق التألق التي تم حلها بمرور الوقت على سد هذه الفجوة.

الأدوات الشائعة للدراسة التجريبية للديناميكيات الجزيئية الحيوية بما في ذلك حنق الجزيء الفردي والرنين المغناطيسي النووي. على مستوى الجزيء الفردي ، تحليل مختلف ، عملية ، الفوتون عن طريق انبعاث فلورسنت الفوتون ، وتشمل هذه التحليل الذي تم حله بمرور الوقت وتحليل تباين الانفجار.

يمكن أن يؤدي استخدام الفلوروفورات المتعددة لتجارب smFRET إلى حدوث تعقيدات في التصميم التجريبي وفي صنع عينات ذات جودة جيدة بما فيه الكفاية. يؤدي استخدام ملصق واحد وتباين الخواص الفلورية إلى حل بعض هذه التعقيدات.

وجدنا أن الشكل الأحادي لمجال الشوكة ل FoxP1 البشري يتصرف كبروتين مضطرب ويزيد من أعصاه القابلة للطي عندما يتجانس.

[مدرب] للبدء ، قم بتصفية محلول المخزن المؤقت القياسي المحضر من خلال مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر. ثم قم بتصفية المخزن المؤقت القياسي من خلال مرشح الفحم لاكتساب جزيء واحد. بالنسبة للمجسات الفلورية ، قم بإعداد كميات صغيرة الحجم من BODIPY Fluorescent Pro المحضر. لمعايرة إعداد الاستقطاب الذي تم حله ، أولا ، قم بتشغيل قنوات الكاشف المتوازية والعمودية وتشغيل الليزر الأزرق. تأكد من ضبط طاقة الليزر على 60 ميكروواط وافتح لوحة التحكم في عد الفوتون الفردي أو برنامج TCSPC المرتبطة بالوقت. بعد ذلك ، امزج ميكرولتر واحد من 100 نانومولار Rhodamine 110 مع 49 ميكرولتر من الماء المقطر. أضف قطرة من سائل الغمر فوق العدسة الموضوعية للمجهر. ضع زجاج الغطاء على هدف المجهر وتأكد من أن قطرة الماء متمركزة على العدسة. أضف 50 ميكرولترا من محلول Rhodamine 110 المخفف إلى وسط زجاج الغطاء لقياسات المعايرة. اضبط مستوى الصورة ليكون داخل المحلول وفوق سطح الزجاج. باستخدام مقبض التركيز البؤري ، حدد موقع النقطة المحورية الساطعة الثانية واضبطها على 1 1/2 دورة. افتح الآن البرنامج في وضع Time-Tagged Time-Resolved وانقر فوق الزر START. سجل معدل العد لمدة 120 ثانية. لقياسات الخلفية ، أضف 50 ميكرولترا من الماء المقطر إلى وسط زجاج الغطاء وكرر الاستحواذ. سجل معدل عدد الفوتون لمدة 300 ثانية واحفظ الملف باسم water.ptu. لقياسات خلفية إضافية، أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت القياسي إلى وسط زجاج الغطاء. سجل معدل عدد الفوتون لمدة 300 ثانية واحفظ الملف ك standard_buffer.ptu. الآن قم بتشغيل برنامج التحليل Burst Integration Fluorescence Lifetime و BIFL وانقر فوق تأكيد الإعداد من النافذة التلقائية. بعد ذلك ، انقر فوق الحصول على معلمات من ملف ، ثم انقر فوق موافق. لتحديد القياس المراد تحليله ، انقر فوق مصفوفة مسار البيانات ، وحدد مجموعة البيانات المناسبة. الآن قم بتحميل ملف قياس المياه water.ptu للمصفوفات ، مثل Green Scatter ، وملف standard_buffer.ptu للخلفية الخضراء ، و Rhodamine110.ptu للسميك الأخضر. ضمن معلمات تحديد الجزيء الفردي، انقر فوق التالي، ثم ضبط لفتح نافذة منبثقة جديدة. ثم اضغط على عتبة لتعديل وقت وصول الفوتون الداخلي واختيار وقت حدث جزيء واحد لمتوسط وقت وصول الفوتون. الآن انقر فوق الحد الأدنى للعدد لتعيين الحد الأدنى لعدد الفوتونات لكل حدث جزيء واحد. ثم أغلق النافذة المنبثقة بالنقر فوق Return و OK. انقر فوق معلمات Color Fit لضبط العمر الافتراضي الأولي للألوان الخضراء والألوان الأخرى باستخدام معلمات اضمحلال الفلورة. قم بتعديل القيم ومطالبتها وتأخيرها عن طريق ضبط القيم من وإلى وإغلاق النافذة المنبثقة. أخيرا ، اضغط على حفظ لمعالجة ملفات ASCII وحفظها في المجلد المحدد. انقل لقاح ما قبل التلقيح بين عشية وضحاها من الإشريكية القولونية C41 إلى 500 مل من وسط LB مع مضاد حيوي مضاف مسبقا بنسبة تخفيف 1: 500. قم بقياس امتصاص المزرعة عند 600 نانومتر لمراقبة نمو المزرعة. عندما تصل الكثافة الضوئية إلى ما بين 0.5 و 0.7 ، أضف IPTG إلى التركيز النهائي البالغ 0.5 مللي مولار للحث على التعبير عن البروتين ، واحتضانه. الطرد المركزي للخلايا البكتيرية عند 3,000 غرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية عندما تصل المزرعة إلى كثافة بصرية من 1.4 إلى 1.6. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتخزين الحبيبات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. بعد ذلك ، أضف 50 إلى 100 ميكرومولار من بروتين FoxP1 إلى زيادة مولار بمقدار عشرة أضعاف من DTT أو TCEP واحتضنها. ضع عمود تحلية PD-10 في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر باستخدام محول عمود لتبادل العازلة. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت PBS إلى العمود لتحقيق التوازن وقم بطرده عند 1,000 جم لمدة دقيقتين. انقل عمود PD-10 إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر ، وأضف ملليلترين من المخزن المؤقت PBS إلى العمود. الآن قم بتحميل 500 ميكرولتر من بروتين FoxP1 في العمود. قم بإزالة العمود عن طريق الطرد المركزي عند 1,000 غرام لمدة دقيقتين لجمع البروتين المنقى. انقل البروتين إلى مرشح طرد مركزي فائق للوزن الجزيئي 10 كيلو دالتون. بعد الطرد المركزي عند 7,500 جم لمدة 10 دقائق ، اجمع التصفيح المركز. قياس تركيز البروتين. ثم أضف BODIPY واحتضن عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين على المدور. كرر التبادل العازلة وتركيز البروتين. بعد تحديد تركيز البروتين ، قم بقياس درجة الملصقات باستخدام الصيغة. أضف 495 ميكرولترا من الماء فائق النقاء وخمسة ميكرولترات من Tween 20 في بئر شريحة الغرفة ، واخلطها جيدا. بعد حضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الغرفة برفق بالماء عالي النقاء مرتين وجففها. لتصحيح تألق الخلفية ، قم بإجراء قياسات لمحلول عازل. معايرة الحساسية النسبية للكاشفات المتوازية والعمودية عن طريق الحصول على بيانات من صبغة سريعة الدوران لتجارب تباين الخواص الفلورية أحادية الجزيء على FoxP1 الأحادي ، أضف 100 BODIPY بيكومولار المسمى FoxP1 و 100 نانو مولار غير مسمى FoxP1 إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت القياسي في شريحة الغرفة. ابدأ القياسات ، وتحقق في برنامج BIFL من أن عدد الرشقات المسجلة في غضون 30 ثانية يتراوح بين 60 و 90. إذا كانت العينة أكثر تركيزا ، فقم بتخفيفها حتى يقع عدد الانفجارات ضمن هذا النطاق. أخيرا ، قم بتحليل القياسات. كشف تحليل عمر تباين الخواص الفلورية أحادي الجزيء عن توزيع واحد ينشأ من وقتين متميزان للارتباط الدوراني في مجال ربط الحمض النووي FoxP1 ، مما يشير إلى التعايش بين المجموعات الهيكلية المنظمة والمضطربة. حدد تحليل تباين الانفجار مجموعة فرعية من جزيئات FoxP1 تظهر تباينا عاليا ومتغيرات زائدة ، مما يشير إلى وجود تغييرات توافقية ديناميكية. ميز تحليل توزيع الفوتون بين حالات FoxP1 الأحادية والثنائية ، مما يدل على توزيعات متباينة الخواص وأسعار الصرف. أثر الاختتاث على الحركات المحلية والعالمية في FoxP1 مع قياسات التباين الزائدة التي تشير إلى تغيرات متباينة الخواص في مواقع محددة تحمل علامة السيستين. كشف تحليل تباين الخواص الديناميكي أن FoxP1 يخضع للتطور الجزئي عند التثمير وربط الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تغيير جزء السكان المنظمين والمضطربين.