نموذج الأنسجة ثلاثي الأبعاد عالي الإنتاجية لقياس عتبات التثقيب الكهربائي

يركز بحثنا على استخدام التثقيب الكهربائي ، وتحديدا نبضات ثنائي القطب ميكروثانية ، من أجل علاج السرطان. نبحث حاليا عن استئصال الأنسجة الرخوة ، لكننا سننتقل أيضا إلى التعداء في الجسم الحي باستخدام هذه النبضات. يمكنك بروتوكولنا في الواقع من الحصول على عرض أكثر كفاءة لعتبات التثقيب الكهربائي التي لا رجعة فيها وقابلة للعكس.

يمكن أن يكون أيضا أفضل قليلا من النظام القائم على المكعب لأنه يسمح لنا بالرؤية في 3D بدلا من بيئة ثنائية الأبعاد. وستكون البيئة ثلاثية الأبعاد أكثر تشابها مع ما نراه في الأنسجة. في المستقبل ، سننظر في محاولة ترجمة ما نراه في هذا النموذج في الجسم الحي ، وما يفعله هذا النموذج حقا هو إبلاغ خيارات المعلمات التي سنتخذها عندما نحاول تقديم أشياء مثل لقاحات الحمض النووي ، والعلاجات الكيميائية ، وكذلك أنظمة كريسبر-كاس9.

للبدء ، ضع تعليق الخلية والكواشف المطلوبة في خزانة السلامة البيولوجية. امزج معلق الخلية المحضر جيدا مع محلول الكولاجين البقري من النوع 1 بنسبة 1: 1. ضع الخليط على الثلج أو في حمام حبة بارد لمنع البلمرة المبكرة.

بعد ذلك ، قم بماصة 500 ميكرولتر من المحلول المركب لتغطية قاع كل بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا. قم بتدوير اللوحة برفق للتأكد من أن الجل يلامس جدران كل بئر. احتضان المواد الهلامية في حاضنة مرطبة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 6 ساعات أو حتى تصبح المواد الهلامية متماسكة.

بعد ذلك ، قم بإمالة لوحة البئر وأضف برفق 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى كل بئر ، واتركها تنزلق على جدار اللوحة. قم بإزالة وصلة الإغراء البلاستيكية من إبرتين من إبرتي حقنة حادة من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 304 ملليمتر. ضع إبرة واحدة جانبا لتكون بمثابة قطب كهربائي للدبوس.

بالنسبة للإبرة الأخرى ، قم بتسطيح آخر 5 ملليمترات من أحد طرفيهم. بعد ذلك ، قم بقطع جزء من أنبوب من الفولاذ المقاوم للصدأ 316 بقطر 19 ملم بما يكفي للجلوس بشكل متدفق على قاع لوحة البئر لإنشاء القطب الحلقي. صمم حامل قطب كهربائي باستخدام برنامج CAD ليناسب مكونات القطب.

قم بتركيب أقطاب الحلقة والدبوس في حامل القطب لتجميع القطب الكهربائي واضغط على تركيب الإبرة مع الطرف المسطح في الحامل لتأمين القطب الحلقي. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بإمالة اللوحة المحضرة واستنشق 400 ميكرولتر من وسط الاستزراع من كل بئر. أضف 20 ميكرولتر من 5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من محلول بلازميد بروتين الفلورسنت الأخضر إلى الآبار المستنشقة.

قم بتدوير اللوحة برفق لضمان انتشار المحلول بالتساوي عبر سطح الجل. احتضن المواد الهلامية في حاضنة مرطبة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أدخل مسبار درجة حرارة الألياف الضوئية في قطب الدبوس وابدأ في تسجيل درجة الحرارة.

قم بتوصيل السلك الموجب للمثقب الكهربائي بقطب الدبوس والرصاص السالب بالإبرة ، مما يؤدي إلى تأمين القطب الحلقي. الآن قم بتشغيل لوح التسخين وقم بتسخين المواد الهلامية للحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية. ثم أدخل الحلقة المجمعة وقطب الدبوس مع مسبار درجة الحرارة في البئر وتأكد من وصول الجل إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية.

قم بتنشيط المثقب الكهربائي لتقديم العلاج. ثم أضف 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى أي مواد هلامية تبدو جافة واستمر في التوصيل الكهربائي لأي مواد هلامية غير معالجة. بمجرد الانتهاء من جميع العلاجات ، احتضن المواد الهلامية في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 دقائق.

بعد الحضانة ، أضف برفق 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى كل بئر على طول جدار اللوحة. احتضن المواد الهلامية مرة أخرى في الحاضنة المرطبة لمدة 24 ساعة. قم بإمالة اللوحة واستنشاق وسط الاستزراع من كل بئر.

ثم أضف برفق 500 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر على طول جدران اللوحة. احتضن المواد الهلامية في حاضنة مرطبة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 دقائق. ثم استنشق PBS من كل بئر.

أضف برفق 500 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر عن طريق السماح لها بالانزلاق على جدار اللوحة. قم بتدوير اللوحة برفق ، ثم قم بإمالتها واستنشاق PBS من كل بئر. الآن ، أضف 100 ميكرولتر من PBS الطازج إلى كل بئر للحفاظ على رطوبة المواد الهلامية للتصوير.

بعد ذلك ، قم بتصوير اللوحة باستخدام تقنيات الفحص المجهري الفلوري القياسية. بعد التصوير ، أضف 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى كل بئر من اللوحة واحتضن لمدة 24 ساعة. كرر سير عمل التصوير والاسترداد الكامل لكل نقطة زمنية محددة.

بعد إنشاء نموذج حسابي ، استخدم برنامج المجهر لقياس قطر كل من الحواف الخارجية والداخلية للمنطقة على شكل حلق على طول المحاور الرأسية والأفقية. احسب متوسط الأقطار الخارجية والداخلية على التوالي واقسم على 2 لحساب أنصاف الأقطار المقابلة. أخيرا ، باستخدام جدول البحث الذي تم إنشاؤه مسبقا ، اشتق شدة المجال الكهربائي عند نصف القطر المقاس.

تم استخدام نصف القطر الخارجي للمنطقة المنقولة لتحديد كمية التثقيب الكهربائي القابل للانعكاس أو عتبة RE من خلال ربطها بشدة المجال الكهربائي من نموذج حسابي. بينما تم استخدام نصف القطر الداخلي لتحديد التثقيب الكهربائي الذي لا رجعة فيه أو عتبة IRE. أدت جميع بروتوكولات النبض الميكروثانية ثنائية القطب الثلاثة إلى مناطق تعداء على شكل طاف مع حدود RE و IRE مرئية بوضوح.

من بين أشكال الموجة التي تم اختبارها ، ولد شكل الموجة المتوازن 2-1-1 أعلى عتبة IRE ، بينما أظهر شكل الموجة غير المتوازن 2-1-1 أدنى. نتج عن بروتوكول التثقيب الكهربائي أحادي القطب القياسي باستخدام 420 فولت منطقة تعداء دائرية بعتبة RE تبلغ 642 فولت لكل سنتيمتر ، لكنه فشل في إنتاج موت الخلايا ، مما منع تحديد عتبة IRE. تسبب تشوه الأنسجة بمرور الوقت بسبب تدهور الهلام في فقدان المناطق المنقولة لشكلها الدائري ، مما يجعل القياس الكمي الدقيق ل RE و IRE صعبا.

كما أنتج اختلال محاذاة أقطاب الحلقة والدبوس مع قاع البئر أنجابا أنماط تعداء غير دائرية غير متماثلة ، مما يعقد قياس العتبة.