بروتوكول قياس الخلوي الكهربائي للفحص المجهري للخلايا الحية والفلورية باستخدام زراعة الخلايا U2 OS

يركز نطاق هذا البحث على تأثير المجالات الكهربائية النبضية على سلوك الخلية ، لا سيما كيف يؤثر التثقيب الكهربائي على دورة الخلية.

الميزة الأساسية لهذا البروتوكول هي القدرة على إجراء تجارب التثقيب الكهربائي المستمرة للخلايا الحية باستخدام زراعة خلايا الثدييات لمدة تصل إلى 72 ساعة. يركز مختبرنا على تكييف هذه التقنيات مع الموائع الدقيقة ، مما سيسمح بأحجام عينات أقل ، وتقليل متطلبات الكاشف ، والتحكم بشكل أفضل في العينة للبروتوكولات المستقبلية.

[الراوي] للبدء ، قم بزراعة خلايا U2OS FUCCI CA5 في صفيحة طولها 10 سنتيمترات مع 10 ملليلتر من الجلوكوز العالي DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في بيئة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. عندما تصل الثقافة إلى 80٪ من التقاء ، استنشق الوسائط من اللوحة. اغسل الخلايا باستخدام PBS ثم أضف ملليلتر واحد من 0.25٪ تربسين واحتضنه لمدة 1.5 دقيقة لفصل الخلايا. تحييد التربسين عن طريق تعليق الخلايا المنفصلة في خمسة ملليلتر من الجلوكوز العالي DMEM. احصل على عينة سعة 100 ميكرولتر من المزرعة المعلقة وضعها على زلة الغطاء الزجاجي السفلي داخل غرفة نظام القياس الخلوي للتثقيب الكهربائي. تأكد من أن الغرفة ملتقية بنسبة 30٪ بعد إدخال العينة. أضف ببطء أربعة ملليلتر من الجلوكوز العالي DMEM إلى الطرف البعيد من الغرفة ، مما يمنع السائل من طرد العينة. ضع شريحة مجهرية قياسية فوق الغرفة واحتضان الغرفة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. قم بتشغيل المجهر الفلوري المقلوب بغرفة تحكم بيئية للسماح للنظام بالاستقرار قبل التثقيب الكهربائي. أثناء استقرار الغرفة البيئية ، استخدم كابلات مشبك التمساح لتوصيل مقياس رقمي متعدد بمكثف مولد النبض ومفتاح الجهد العالي للإعداد السريع مع غرفة التثقيب الكهربائي. الآن ، حدد تكبير 20x على المجهر. في برنامج المجهر ، تأكد من تحديد قنوات FITC / GFP و A594 Texas Red M Cherry المقابلة لبروتيني الفلورسنت في نظام FUCCI CA5. استخدم إعدادات التعريض الضوئي المنخفض، عادة أقل من 0.05 ثانية، لمنع تلف الصورة أثناء التصوير على المدى الطويل. التقط صورا تجريبية لتحسين تركيز الصورة وجودتها قبل بدء التصوير بفاصل زمني. قم ببرمجة الفاصل الزمني لالتقاط الصور من ثلاث إلى ست وجهات نظر مختلفة كل 10 دقائق على مدار 24 ساعة للحصول على حجم كبير من بيانات دورة الخلية لكل فاصل زمني مع التخفيف من تلف الصورة. تأكد من تمكين التركيز البؤري التلقائي لقناة A594 لتحسين تتبع الثقافة أثناء الفاصل الزمني. اترك البرنامج مفتوحا حتى يكتمل التثقيب الكهربائي. ضع غرفة قياس التثقيب الكهربائي الخلوي في المجهر المجهز بغرفة بيئية مناسبة. قبل التثقيب الكهربائي ، حافظ على الغرفة مغلقة وتأكد من استمرار تشغيل النظام البيئي للحفاظ على ظروف دورة الخلية المناسبة. افتح الغرفة البيئية وقم بتوصيل مقياس رقمي متعدد بمولد النبض ، ثم باستخدام كبلات مشبك التمساح ، قم بتوصيل مولد النبض بأقطاب الغرفة. اشحن مكثف مولد النبض إلى 180 فولت. قم بتفريغ النبضة في الغرفة بسرعة حتى يعرض المقياس الرقمي المتعدد صفر فولت. قم بإزالة جميع التوصيلات الكهربائية من الغرفة واستبدل غطاء الغرفة على الفور لضمان ظروف الزراعة المثلى. قم بتنشيط تصوير الفاصل الزمني على الفور بمجرد وضع الغرفة البيئية في مكانها بشكل آمن. بعد اكتمال الفاصل الزمني ، استخدم برنامج المجهر لحفظ جميع الصور الملتقطة كفيديو واحد. اضبط الجودة المرئية لتحسين وضوح ميزات الخلية للقياس الكمي اليدوي. أخيرا ، لاحظ التغييرات في إشارات FITC و A594 بمرور الوقت لتتبع مراحل الخلية في فيديو الفاصل الزمني. باستخدام نظام فوجي ، تم جمع البيانات المرئية من خلال تتبع تغيرات اللون المرتبطة بتعبير البروتين وانتشاره في كل مكان ، مما يسمح بالتمييز الواضح لمراحل G1 و S و G2 و M. مكن هذا من المراقبة المباشرة لتقدم دورة الخلية في ظل ظروف مختلفة. يقدم هذا الشكل ملخصا للبيانات الرئيسية التي تم جمعها من مجموعتين من التجارب باستخدام ثقافات الخلايا غير المتزامنة والمتزامنة في المرحلة S. أدى التعرض للمجال الكهربائي النبضي في الخلايا غير المتزامنة إلى زيادة كبيرة في متوسط طول مراحل G1 و G2 و M ، بينما ظلت المرحلة S دون تغيير. في الخلايا المتزامنة ، أدى التعرض للمجال الكهربائي النبضي إلى تقليل فترات مراحل G1 و S و G2 ، على الرغم من أن S و G2 فقط كانا ذا دلالة إحصائية ، بينما ظلت المرحلة M غير متأثرة.