التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة وخالي من الملصقات وتحليل التعلم الآلي للعضيات المعوية عبر التصوير المجسم منخفض التماسك

نحن نهدف إلى إنشاء طرق تصوير في الوقت الفعلي وخالية من الملصقات عند مراقبة التغيرات الفيزيائية الحيوية في العضيات الحية أثناء التطوير والاستجابة للأدوية. يسهل هذا البروتوكول نطاقا مبسطا للتصوير واختبار الأدوية غير الغازية في العضيات الحية المدعومة بالطفرة التي تحركها الذكاء الاصطناعي واختيار الملمس الكمي للبحوث الطبية الحيوية. نحن نخطط لدمج التصوير ثلاثي الأبعاد الخالي من الملصقات وتحليل لمدة عام لدراسات العضيات عالية الدقة وغير الغازية في نمذجة الأمراض والطب الدقيق.

للبدء ، استنشاق الوسط المستهلك من كل بئر من صفيحة مكونة من 48 بئرا تحتوي على المصفوفة خارج الخلية. أضف 200 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا إلى كل بئر واحتضن عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. باستخدام ماصة ، اجمع المعلق العضوي برفق وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 150 جم لمدة ثلاث دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية. لفصل الحبيبات ميكانيكيا، أعيد تعليقها في 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع وماصة التعليق لأعلى ولأسفل من 20 إلى 30 مرة باستخدام ماصة P200 قبل طردها بالطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية، أضف مصفوفة متوسطة وطازجة خارج الخلية، أو ECM، بنسبة واحدة إلى أربعة إلى الحبيبات والماصة برفق لخلطها جيدا.

قم بتوزيع 15 ميكرولتر من الخليط لكل قبة في كل بئر من طبق 48 بئر. ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة للسماح ببلمرة وحدة التحكم في المحرك (ECM). بعد البلمرة ، أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج إلى كل بئر ، واملأ الآبار الخارجية الفارغة ب PBS.

لتحضير العينة للتصوير ، قم بتوزيع 15 ميكرولتر من قبة ECM العضوية على طبق تصوير سفلي رقم 1.5 واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. ضع الطبق رأسا على عقب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة. ثم أضف برفق ما يكفي من وسط الاستزراع لغمر المواد العضوية بالكامل.

بعد خمسة أيام من المرور ، اغسل العينة مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام PBS مباشرة قبل التصوير. بعد ذلك ، للتصوير ، قم بتشغيل وحدة التحكم البيئية. ستقوم وحدة التحكم في الغرفة تلقائيا بضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون على 5٪ اضغط على زر الباب لفتح الباب.

أضف الماء لتشكيل طبقة رقيقة داخل الغرفة جيدا. ضع طبق التصوير في حامل الوعاء ، وأدخله في غرفة التصوير ، وثبته باستخدام دبوس لمنع الحركة. أغلق الباب لمنع تداخل الضوء الخارجي.

الآن ، قم بتشغيل برنامج TomoStudio X وقم بتسجيل الدخول. انقر فوق ابدأ لفتح النافذة الرئيسية، ثم انقر فوق إضافة مشروع في الزاوية العلوية اليمنى وقم بتعيين التجربة. تأكد من تحديد نوع الوسيط الصحيح لاستخدام معامل الانكسار المناسب.

انقر فوق البئر المطلوب في اللوحة ثم انقر فوق إنشاء في الجزء العلوي لتسجيل البئر كعينة. ثم انقر فوق إعداد ROI في الزاوية اليمنى العليا لتحديد منطقة الاهتمام في الطبق. بمجرد التعيين ، انقر فوق تشغيل التجربة في الزاوية اليمنى السفلية لفتح نافذة اكتساب الصور.

انقر فوق Load Vessel في الزاوية لعرض صورة مجال ساطع. اضبط موضع Z باستخدام الزرين Z و Z لتركيز الصورة على البؤرة. في علامة التبويب تصوير فردي، اضبط حجم عائد الاستثمار.

التقط العضيات في مجال رؤية 160 ميكرومتر × 160 ميكرومتر واحصل على أكوام يصل عمقها إلى 140 ميكرومتر. انتقل إلى علامة التبويب تصوير الفاصل الزمني لإعداد التصوير طويل المدى وتعيين المدة والوقت الفاصل الزمني المطلوبين. انقر فوق رمز المسح الضوئي لالتقاط موقع عائد الاستثمار الحالي.

انقر فوق الزر BF لضبط قيم الشدة والتعريض الضوئي لتصوير المجال الساطع. حرك مربع عائد الاستثمار في لوحة المعاينة لتحديد عائد الاستثمار. بمجرد تحديد عائد الاستثمار المطلوب ، انقر فوق إضافة نقطة في الجزء السفلي ، وسيتم إنشاء قائمة نقاط التصوير.

الآن ، انقر فوق اكتساب لبدء التصوير والحصول على بيانات الصورة الأولية. قم بتشغيل خادم معالجة HTX بالنقر فوق أيقونة سطح المكتب. قم بسحب ملفات الصور الأولية وإفلاتها إلى خادم معالجة HTX.

انقر فوق معالجة لإنشاء ملف TCF من ملف الصورة الأولية. قم بتشغيل TomoAnalysis Viewer بالنقر فوق أيقونة سطح المكتب. قم بتحميل ملفات إطار الشفافية والموافقة التي تمت معالجتها عن طريق سحبها وإفلاتها في نافذة العارض.

انقر نقرا مزدوجا فوق صورة مصغرة للملف لفتح الرسم المقطعي لعائد الاستثمار. افحص طريقة العرض ثنائية الأبعاد من خلال التنقل عبر المستويات X وY وZ باستخدام عناصر التحكم في التكبير/التصغير والتحريك والتمرير. انقر فوق أيقونة عرض عرض MIP على اليسار للتبديل إلى وضع العرض ثلاثي الأبعاد.

تنقل في طريقة العرض ثلاثية الأبعاد عن طريق تدوير الصورة وتكبيرها وتحريكها. بالنسبة لتجزئة الصور المستندة إلى التعلم الآلي ، قم بتصدير ملف صورة TCF إلى تنسيق HDF5 للتأكد من أن البيانات بتنسيق متعدد الأبعاد ، متوافق مع ilastik. افتح ilastik وانتقل إلى مشروع جديد.

حدد تصنيف البكسل ضمن قسم سير عمل التجزئة واحفظ المشروع في مجلد معين. لتحميل ملف HGF5، انتقل إلى علامة التبويب بيانات الإدخال، وانقر فوق إضافة ملف جديد، وحدد مجموعة بيانات H5 المناسبة، وتحقق من تعيينات قناة الصورة الصحيحة. الآن ، انتقل إلى علامة التبويب "تحديد الميزة" لاختيار ميزات مثل اللون والكثافة والحافة والملمس لتحسين التجزئة.

في علامة التبويب تدريب، قم بتسمية المناطق العضوية وغير العضوية باستخدام ضربات فرشاة بألوان مختلفة. انقر فوق التحديث المباشر لمعاينة نتائج التجزئة وإجراء التعديلات، إذا لزم الأمر. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انتقل إلى علامة التبويب تصدير التنبؤ.

حدد تجزئة بسيطة كمصدر لتصدير التنبؤات المسماة وانقر فوق تصدير الكل. قم بتعيين تنسيق التصدير إلى H5 أو TIFF بناء على متطلبات التحليل. للتحليل الكمي ، افتح ملف الترميز التكميلي 2.

قم بتعيين مسارات المجلد المناسبة لملف القناع وملف TCF المقابل داخل البرنامج النصي. قم بتشغيل التعليمات البرمجية لبدء التحليل الكمي. سيحسب الكود الحجم العضوي وكثافة البروتين ومحتوى البروتين الكلي لكل مجموعة بيانات.

يوضح هذا الشكل إعادة بناء معامل الانكسار ثلاثي الأبعاد عالي الدقة المستخدمة لتصور التشكل العام للعضويات المعوية الدقيقة. تكشف عمليات إعادة البناء المقدمة عن اختلافات هيكلية واضحة بين العضيات المعالجة بالسيارة والمعالجة بالسيسبلاتين عبر جميع أعماق المقاطع البصرية الثلاثة. أظهرت العضيات المعالجة بالسيسبلاتين حجما أعلى بشكل ملحوظ ، وكثافة بروتين أقل ، ومحتويات بروتين إجمالية أعلى ، مقارنة بالعضيات المعالجة بالسيارة بعد 10 دقائق من العلاج ، مما يشير إلى تورم هيكلي مبكر وتكوين بروتيني متغير.

أظهر التصوير بفاصل زمني على مدار 24 ساعة أن العضيات المعالجة بالسيارة حافظت على السلامة الهيكلية ، بينما شهدت العضيات المعالجة بالسيسبلاتين تدهورا هيكليا تدريجيا ، بما في ذلك انهيار القبو وزيادة تفكك الخلايا ، مما يشير إلى تلف سام خلوي يعتمد على الوقت. أكد التتبع الكمي أن العضيات المعالجة بالسيارة زادت في الحجم ومحتويات البروتين بمرور الوقت ، بينما أظهرت العضيات المعالجة بالسيسبلاتين انخفاضا يعتمد على الوقت في كلا المعلمتين ، مما يشير إلى أن السيسبلاتين قمع النمو وتسبب في التدهور الخلوي. ظلت كثافة البروتين مستقرة في المواد العضوية المعالجة بالسيارة ، لكنها انخفضت تدريجيا في العضيات المعالجة بالسيسبلاتين على مدار 24 ساعة ، مما يشير إلى انهيار في التركيب الخلوي وزيادة المساحة خارج الخلية بسبب التقشير.