القياس الكمي ثلاثي الأبعاد لمخاط الأمعاء باستخدام تصوير الأنسجة الكاملة

تركز أبحاثنا على آليات الحقن الميكروبي بأنسجة الغشاء المخاطي، مع التأكيد على الدور المحوري للمخاط في تنظيم هذه التفاعلات. القياس التقليدي ثنائي الأبعاد للمخاط يغفل التفاصيل المكانية والحجمية. يتيح بروتوكولنا التحليل ثلاثي الأبعاد الدقيق، كاشفا عن التغيرات الهيكلية والتوزيعية الناتجة عن التدخلات الجزيئية التي يتم تجاهلها في الطرق الحالية.

يجمع هذا البروتوكول بين التصوير الهرموني والقياس ثلاثي الأبعاد، مما يوفر قياسات قوية وقابلة للتكرار لبنية مخاط الأمعاء قابلة للتطبيق على ظروف تجريبية متنوعة وتدخلات جزيئية متجاوزة التقييم ثنائي الأبعاد التقليدي. للبدء، ضع فأرا مخدرا عمره من ستة إلى ثمانية أسابيع على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسمه. قم بتعقيم سطح جلد الفأر بالكحول، وقم بعمل شق في أسفل البطن الأيسر لكشف السيكوم مع الحفاظ على التخدير.

الآن، حدد العضلة اللفائفية أو القولون القريب. ضع حلقة الأمعاء على شاش معقم. اشطف باستخدام PBS معقم وثبت كلا الطرفين بمشابك شريانية لإنشاء حلقة مغلقة بطول ثلاثة سنتيمترات.

تحت التخدير، يجب حقن لا يزيد عن 200 ميكرولتر من مادة PBS المعقمة أو كاشف كلوريد الكارباموميل كولين في حلقة الأمعاء المربوطة. بعد 30 دقيقة من العلاج، احصد حلقة الأمعاء من الذي تم إعداده رحيما. باستخدام الملقط، أمسك حلقة الأمعاء وشطفها بلطف في PBS معقم.

افتح الحلقة المعوية طوليا، مع جزء صغير غير مقطوع، ثم اشطف الأنسجة مرة أخرى باستخدام PBS معقمة. افرد النسيج في طبق بحجم ستة سنتيمترات واقطع الجزء المتبقي. استخدم مقاطع من الأسلاك النحاسية لتثبيتها على قاعدة الأغاروز.

الآن، أضف 10 ملليلتر من محلول بارافورمالديهايد 4٪ إلى الطبق لتثبيت النسيج لمدة 12 إلى 24 ساعة. بعد الحضانة، أزل محلول بارافورمالديهايد وغسل النسيج ثلاث مرات على الأقل باستخدام PBS لإزالة أي بقايا بارافورمالديهايد. بعد ذلك، اغمر النسيج في 10 ملليلتر من محلول حاجز يتكون من PBS مدعوم ب 0.4٪ ترايتون X-100 و3٪ BSA، وتخزينه عند أربع درجات مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة.

أزل المخزن الحاجز. صبغ الأنسجة بمحلول صبغي يحتوي على جرثومة القمح والأغلوتينين والفالودين. في الأنسجة العلاجية للمعاء الدقيقة والقولون المعالجة بمتلازمة PBS، كان المخاط الإيجابي ل WGA متمركزا بشكل رئيسي داخل خلايا الكأس على سطح الظهارة.

بعد معالجة كلوريد الكاربامويل كولين، زادت كمية المخاط الإيجابي ل WGA في تجويف الأمعاء بشكل ملحوظ في كل من الأمعاء الدقيقة والقولون، لكن المخاط كان يتبعثر بشكل متقطع بدلا من تكوين طبقة مستمرة. انخفض حجم المخاط المرتبط بخلايا الكأس الإيجابية ل WGA بشكل ملحوظ بعد معالجة كلوريد الكاربامويل كولين في كل من الأمعاء الدقيقة والقولون، مما يشير إلى الإفراز النشط. جميع أحجام مخاط خلايا الكأس في الأنسجة المعالجة ب PBS كانت أقل من 1,000 ميكرومتر مكعب.

تم تصنيف العناصر الموجبة في WGA التي تتجاوز 1,000 ميكرومتر مكعب كمخاط مفرز في التلومين. زاد علاج كلوريد الكاربامويل كولين من الحجم الكلي للمخاط المفرز بحوالي خمسة إلى عشرين ضعفا في كل من الأمعاء الدقيقة وأنسجة القولون.