رسم خرائط تفاعلات البروتين والبروتين المختلة في المرض

يقوم عملنا برسم خريطة للتفاعلات المختلة بين البروتين والبروتين مباشرة من الخلايا والأنسجة الأصلية، كاشفا كيف يعيد المرض توصيل الشبكات الخلوية. على عكس معظم الطرق بين الذرات، لا يتطلب dfPPI هندسة وراثية ومهارات من مجموعات المرضى، باستخدام التقاط متعدد واحد لكل عينة. للبدء، حضر محلول استخراج البروتين يحتوي على 20 ملليمولر تريس، 20 ملليمولر كلوريد البوتاسيوم، 5 ملليمولات كلوريد المغنيسيوم، و0.01٪ Nb-40.

أضف مثبطات البروتياز والفوسفاتاز مباشرة قبل الاستخدام وحافظ على العزل على الثلج. ضع عينة الأنسجة المجمدة في أنبوب تجانس للأنسجة الدقيقة مزود بمدقة. أضف 500-700 ميكرولتر من محلول التحلل الأصلي، مع تعديل الحجم بناء على تماسك الأنسجة وسهولة التجانس.

ثم توحيد العينة على الثلج عن طريق تحريك المدقة بلطف للأعلى والأسفل وضد الجدران الكاشطة حتى يتم الحصول على تعليق متجانس. حضن الليزات عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عن طريق وضع القارورة على وحدة دوران. اخلط العينات بلطف أثناء الحضانة عبر التناوب.

باستخدام جهاز طرد مركزي على سطح المطبخ، قم بطرد المركزي بالعينات عند حرارة 13,000 جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي. اجمع المواد الفائقة بعناية وانقلها إلى أنابيب طرد مركزية دقيقة شفافة بسعة 1.5 ملليلتر. حدد تركيز البروتين الكلي في المادة الفائقة باستخدام مجموعة اختبار BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

بعد ذلك، خذ مجموعة من خرز البولي يوريثان مباشرة من مخزون الإيزوبروبانول. دع الخرزات تستقر لإزالة مذيب التخزين. استنشق الأيزوبروبانول بحذر، ثم أضف محلول التحلل الأصلي وأعد تعليق الخرز بالكامل عن طريق التوصيل اللطيف أو الانقلاب.

لغسل وتوازن الخرزات، قم بتدوير الأنبوب ثم قم بعمل طرد مركزي. بعد ذلك، استنشق المادة الفائقة باستخدام خط تفريغ مزود بطرف ماصة، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبة. أضف حاجز الربط إلى الخرز المغسول بنسبة متساوية لخلق خليط خرز يعمل بشكل متجانس.

أليكوت 40 ميكرولتر من خليط البولي يوريثان في أنابيب الطرد المركزي الدقيق بحجم 1.5 ملليتر، باستخدام طرف ماصة مقطوع للتوزيع السلس. ثم اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام مخزن التحلل الأصلي بإضافة 1 ملليلتر من المخزن لكل أنبوب. قم بتدوير الأنبوب لإعادة تعليق الخرز، ثم قم بعمل الطرد المركزي عند 10,000 جرام لمدة دقيقة واحدة وتخلص من المادة الفوقية عن طريق الشفط.

بعد الغسل النهائي، أزل معظم السائل المتبقي من الأنابيب، لضمان بقاء حبيبة الخرزة دون إزعاج. أضف مستخلصات البروتين المطبعة إلى أنابيب طرد مركزية دقيقة بحجم 1.5 ملليلتر تحتوي على 40 ميكرولتر من خليط خرزات التحكم. اضبط الحجم النهائي إلى 250 ميكرولتر بإضافة الكمية المناسبة من مخزن التحلل الأصلي.

حضن العينات عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة مع تدوير على دوار من الطرف فوق الطرف يعمل بسرعة 10-15 دورة في الدقيقة. قم بعمل الطرد المركزي على الأنابيب عند 10,000 جرام لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية لدفع حبيبات التحكم مع البروتينات المجمعة أو غير القابلة للذوبان. اجمع المادة الفائقة بعناية من خرزات التحكم باستخدام ماصة بسعة 1 ملليلتر وانقلها إلى أنابيب جديدة بسعة 1.5 ملليلتر تحتوي على 40 ميكرولتر من خليط خرز البولي يوريثان المغسول.

حضن العينات عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات مع تدوير على دوار من الطرف فوق الطرف. بعد الطرد المركزي للأنابيب بعناية، استنشق المادة الفائقة واغسل الخرزات أربع مرات، كما أوضحت سابقا. قم بإزالة أي بقية من PBS من الأنبوب.

أعد تعليق الخرزات المغسولة في 80 ميكرولتر من يوريا 2 مول، محضرة حديثا في بيكربونات الأمونيوم بحجم 50 ميلي مول عند درجة حموضة 8.5 عن طريق التوصيل بالماصات أو الدوامة القصيرة. ثم أضف الديثيوثرايتول لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1 ملي مولر. بعد تغطية الأنبوب، حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز بسرعة 1,100 دورة في الدقيقة على هزاز مداري ساخن.

أضف يودوأسيتاميد للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 3.67 مليمولر. حضن الأنابيب في الظلام ودرجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع هز بسرعة 1,100 دورة في الدقيقة. الآن، أضف المزيد من الديثيوثرايتول لتبريد أي يودوأسيتاميد غير متفاعل، مما يضمن تركيزا نهائيا يبلغ 3.67 مليمولر وامزجه بلطف عن طريق الماصات.

أضف 750 نانوجرام من 0.5 ملليغرام لكل ملليتر بروتيز Lys-C بدرجة مطيافية الكتلة إلى العينة. حضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة مع رجزه بسرعة 1,150 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، أضف 750 نانوجرام من التريبسين الطازج المحضر حديثا بدرجة 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر بدرجة التسلسل إلى العينة.

حضن الخليط طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع رج بمعدل 1,150 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، قم بالطرد المركزي للعينة عند 1,000-5,000 جرام لمدة 1-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل المادة الفائقة بحذر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة، وتخلص من الخرز.

اضبط درجة الحموضة للهضم إلى أقل من 3 بإضافة 50٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بشكل قطري. تحقق من درجة الحموضة باستخدام شرائط المؤشر. التقطت حبيبات PU-beros بقوة HSP90 وHSC70 والبروتينات الساخنة من اللايزات عالية الإبيكابيروم مع إشارة قليلة من إبيكابيروم منخفض التحلل، مما يؤكد الخصوصية البيولوجية للمجس.

أظهر ملف حمولة خرزة PU إشارة غنية وعالية الوزن الجزيئي في مسار خرزات PU-swed وخلفية قليلة في مسار خرزات التحكم، مما أكد نجاح نشاط المسبار. أظهرت جل SDS-PAGE المصبوغ بكوماسي توزيع متسق للنطاق عبر أربع عينات معالجة داخل الجل، مما أكد نجاحا في إثراء مركبات البروتين من الليزات الأصلية قبل مطيافية الكتلة. تم تأكيد قابلية التكرار التقنية من خلال تحليل المكونات الرئيسية، حيث تجمعت العينات المكررة بشكل محكم بينما كانت العينات المختلفة منفصلة بشكل نظيف.

أظهرت توزيعات شدة الأيونات الأولية أن معظم الميزات كانت لها معاملات تباين أقل من 20٪ مع قيم وسيطة بين 9.7٪ و11.9٪ عبر العينات، مما يؤكد الكشف والاسترداد المتسق للببتيدات. أظهر التجميع الهرمي لوفرات البروتينات المحولة لوغاريتميا عن فصل قوي للعينات والحفاظ على تباين بين العينات مع شدة بروتين تتراوح من الوفرة المنخفضة إلى البروتينات عالية الإثراء. أظهر تحليل إثراء المسارات تغطية واسعة للتعليقات التوضيحية عبر عدة أنطولوجيات، بما في ذلك فئات أنطولوجيا الجينات وقواعد البيانات المنسقة مثل Reactome وKEGG وWikiPathways.

سمح لنا dfPPI باكتشاف رؤى ميكانيكية وعلاجية لا تستطيع الأساليب الأخرى الوصول إليها. يرفع dfPPI الانقسامات إلى مستوى مجموعات الأمراض الواقعية والحالات الأصلية، مما يتيح فرضية ميكانيكية وعلاجية دقيقة. نحن الآن نوسع dfPPI لرسم خريطة التغيرات على مستوى الشبكة في الأمراض التنكسية العصبية، مثل الزهايمر وباركنسون.