Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

1. 材料
缓冲液
<ol>
	<li>洗涤缓冲液：不含钙和镁的1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）</li>
	<li>固定缓冲液：含1%多聚甲醛的PBS</li>
	<li>透化缓冲液：含0.1% Triton X-100的PBS</li>
	<li>封闭缓冲液：含1%牛血清白蛋白的PBS</li>
	<li>细胞培养基：DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺</li>
</ol>
仪器设备
<ol start="6">
	<li>层流罩</li>
	<li>恒温恒湿培养箱（37°C，5% CO2）</li>
	<li>共聚焦激光扫描显微镜；此处使用的是尼康 Eclipse Ti 激光显微镜</li>
</ol>
材料与试剂
<ol start="9">
	<li>带腔室的细胞培养载玻片</li>
	<li>含DAPI的抗荧光淬灭封片介质（用于细胞核染色）</li>
	<li>显微镜盖玻片</li>
	<li>无尘擦拭纸</li>
	<li>移液器及吸头</li>
</ol>
特定检测用试剂
<ol start="14">
	<li>贴壁细胞（原代细胞或细胞系）；此处使用转染了 CD1d 的小鼠成纤维细胞（LCD1）。</li>
	<li>用于检测细胞靶标的初级抗体；此处使用大鼠抗小鼠 CD107a（LAMP-1）和小鼠抗小鼠 CD1d 抗体。</li>
	<li>针对初级抗体同种型的荧光染料标记的二抗；此处使用与 Alexafluor 488 偶联的抗大鼠 IgG 和与 Alexafluor 647 偶联的抗小鼠 IgG。</li>
</ol>
2. 实验方案
抗体染色前的准备
接种细胞
<ol>
	<li>用培养基重悬目标细胞。</li>
	<li>随后，将500 µL细胞悬液/孔接种至4孔细胞培养板的各孔中。（此处，将LCD1细胞以每孔2.5×105个细胞的密度接种于500 µL培养基中。不同细胞系的接种密度可能有所不同）。</li>
	<li>将培养板置于37°C、5% CO2培养箱中过夜孵育，使细胞贴附于玻片表面。</li>
	<li>次日，吸除各孔中的培养基，然后用500 µL PBS洗涤细胞1次。</li>
</ol>
固定
<ol start="5">
	<li>为固定细胞，向每个孔中加入 500 µL 1% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，将多聚甲醛收集至适当的危险液体废物容器中。</li>
	<li>然后用 500 µL PBS 洗涤细胞 3 次，以去除固定剂的残留物。</li>
</ol>
透化
<ol start="8">
	<li>在室温下用 500 µL 通透缓冲液/孔孵育细胞 15 分钟，以进行细胞通透处理。</li>
	<li>随后用 500 µL PBS 短暂洗涤细胞 3 次。</li>
</ol>
封闭
<ol start="10">
	<li>每孔加入 500 µL 封闭缓冲液，在 4°C 下孵育 1 小时，以阻断非特异性抗体结合。</li>
</ol>
一抗孵育
<ol start="11">
	<li>吸出玻片腔室中的封闭缓冲液。</li>
	<li>然后向细胞中加入 500 µL 稀释后的一抗溶液。（此处，抗 CD107a (LAMP-1) 抗体按 1:500 稀释，抗 CD1d 抗体未稀释使用（1H6 单克隆抗体由 Dr. Randy Brutkiewicz 惠赠））。</li>
	<li>将玻片于 4°C 条件下孵育过夜。</li>
</ol>
注意：如果同时检测多个靶标，请确保一抗属于不同的同种型。推荐的抗体浓度因生产商而异，使用前应进行滴定。
二抗孵育
<ol start="14">
	<li>吸出各孔中的第一抗体溶液。</li>
	<li>用 500 µL PBS 洗涤孔腔 4 次。</li>
	<li>然后，向每孔加入 500 µL 稀释后的第二抗体溶液。（此处，第二抗体 anti-mouse IgG Alexafluor 647 和 anti-rat IgG Alexafluor 488 均用封闭缓冲液按 1:2000 比例稀释）。</li>
	<li>室温避光孵育 1 小时。</li>
	<li>孵育结束后，吸出第二抗体溶液。</li>
	<li>用 500 µL PBS 洗涤孔腔 4 次，以去除未结合的第二抗体。</li>
</ol>
注意：推荐的抗体浓度因生产厂家而异，使用前应进行滴定。若同时检测多个靶标，二抗必须偶联具有独特激发/发射光谱的不同荧光染料。选择荧光染料时，还需考虑核复染剂（如 DAPI）的激发/发射光谱。共聚焦显微镜的激光器配置可能影响荧光染料的选择，仪器的激光配置将决定哪些荧光染料适用于该实验。
3. 盖玻片封片
<ol>
	<li>首先，小心地将腔室从载玻片上移除。</li>
	<li>然后，将载玻片倾斜置于一张精细擦拭纸上，从边缘去除液体，注意不要触碰细胞。</li>
	<li>向每部分细胞区域滴加一滴含有细胞核染料 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。</li>
	<li>接着，用指尖捏住盖玻片边缘，将其覆盖在载玻片上，尺寸为 20 mm × 60 mm。（避免在细胞区域形成气泡，以免影响成像）。</li>
	<li>用精细擦拭纸擦去侧面多余的封片剂，并将载玻片置于避光环境中，室温保存，最长可保存一周。</li>
</ol>
4. 共聚焦成像
在共聚焦激光扫描显微镜上获取的图像样本。图2所示数据使用尼康Eclipse Ti A1R显微镜配合NIS Elements Advanced Research软件采集。下文详述使用上述软件进行图像采集的操作步骤。
<ol>
	<li>开始成像细胞时，点击“NIS软件图标”打开“NIS Elements Advanced Research软件”。</li>
	<li>接着，在控制窗口中点击“TiPad”选项卡，并选择用于成像的物镜。（此处首先使用了40倍物镜）。</li>
	<li>将载有细胞的玻片加载到载物台上，并将其居中置于物镜下方。</li>
	<li>现在，在“A1plus Compact GUI”选项卡中，根据所用荧光染料设置相应的激光器。点击齿轮图标以打开染料和光谱设置菜单，选择所需的通道，并为每个通道设置对应的激光器。</li>
	<li>然后，在第一个二向色镜下方的下拉菜单中选择适当的发射波长。</li>
	<li>接下来，在“A1plus Compact GUI”窗口中点击“Ch. Series”，以设置扫描线通道序列，该设置决定所用激光器是同时还是依次照射样品。（此处选择了顺序扫描，依次为通道1、通道2，然后是通道4）。</li>
	<li>之后，点击顶部的“箭头尖端”图标开始扫描。在实时成像过程中，在“A1plus Compact GUI”窗口中点击滑动条，调整针孔大小，以确保排除离焦光线。（此处使用了最低可用设置（0.5））。</li>
	<li>接着，通过滑动条调节每个激光器下的“高压”和“偏移”设置至适当水平，以便在检测特异性染色的同时尽量减少潜在的背景染色。如果有阳性染色样本，可先对每个通道成像该样本，以确保激光设置获得最佳信噪比。 
	注意：长时间使用高激光强度可能导致光漂白。</li>
	<li>在为每个激光器设置好最佳的高压和偏移值后，点击“ND Acquisition选项卡”，然后选择“Z”图标以设置z序列参数。接着，在获取样品实时图像的同时，首先通过找到图像底部并点击“底部”按钮来设定下限，再找到样品顶部位置并点击“顶部”按钮设定上限。可通过直接输入每步所需的步长（单位为µm）或指定总步数来设置步长大小。</li>
	<li>设置完z序列参数后，选择所需图像的尺寸/像素分辨率。为此，请点击“A1plus Compact GUI”窗口，在“尺寸”图标下选择所需的分辨率。为降低图像噪声，可在“ø”符号旁的下拉菜单中选择图像平均次数。</li>
	<li>现在，点击“ND Acquisition菜单”中的“立即运行”选项卡，以开始对样品进行成像。</li>
	<li>成像完成后，点击“文件”，然后选择“另存为”，将图像文件以“.nd2”扩展名导出。最后，对其他每个样品重复上述过程。</li>
</ol>

共聚焦荧光染色是一种相对简单的实验方法，可获得高质量的图像，其样本制备方式与常规荧光显微镜相似。简而言之，样本首先经过固定、通透化处理，然后进行封闭。加入针对目标蛋白的一抗使其结合，再使用荧光素标记的二抗来显示染色结果。共聚焦荧光显微镜在多个研究领域具有广泛应用。例如，通过同时对亚细胞器标志物和目标蛋白进行染色，可利用共聚焦显微镜确定不同蛋白的亚细胞定位。与常规荧光显微镜相比，共聚焦成像能更有效地分辨蛋白位于细胞表面还是细胞内。此外，共聚焦成像还可用于判断两种蛋白是否在细胞内共定位。尽管本方案未详细说明，共聚焦荧光显微镜也可用于活细胞，以检测动态变化。
<img alt="细胞的荧光显微镜图像；蛋白质定位研究，绿色和蓝色标记。" src="/files/ftp_upload/10501/10501vid1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="视频 1"> 
视频 1： 使用 NIS Elements Advanced Research 软件创建的视频，展示了在图像的三维重建中进行浏...

共聚焦荧光显微镜技术：一种用于确定小鼠成纤维细胞中蛋白质定位的方法

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

来源：Dominique R. Bollino1，Eric A. Legenzov2，Tonya J. Webb1 
1 马里兰大学医学院微生物学与免疫学系及Marlene和Stewart Greenebaum综合癌症中心，美国马里兰州巴尔的摩市 21201 
2 马里兰大学医学院生物医学工程与技术中心，美国马里兰州巴尔的摩市 21201
共聚焦荧光显微镜是一种成像技术，与传统的“宽场”落射荧光显微镜相比，能够提供更高的光学分辨率。共聚焦显微镜通过“激光扫描”实现更优的x-y平面光学分辨率——通常采用一组电压控制的反射镜（即检流计或“galvo”反射镜），将激光依次照射到样品的每一个像素点上。更重要的是，共聚焦显微镜利用针孔滤除来自非焦平面（即当前扫描z平面以外）的离焦光线，从而显著提高z轴方向的分辨率，使探测器仅采集特定z平面的信号。由于共聚焦显微技术可实现较高的z轴分辨率，因此能够采集一系列z平面（也称为z层栈）的图像，并通过软件重建出三维图像。
在讨论共聚焦显微镜的工作原理之前，有必要了解样品与光之间的相互作用。光由光子组成，光子是电磁能量的微小单元。当光子照射到生物样品上时，可能以四种方式之一与样品中的分子发生相互作用：1）光子未发生相互作用并直接穿过样品；2）光子被反射或散射；3）光子被分子吸收，其能量通过一系列被称为非辐射衰减的过程以热能形式释放；4）光子被吸收后，能量迅速以次级光子的形式重新发射，这一过程称为荧光。具有能够产生荧光发射结构的分子被称为荧光基团。大多数生物样品中内源性荧光基团含量极低，因此必须使用外源性荧光基团来标记样品中感兴趣的结构。在荧光显微镜观察过程中，使用特定波长的光照射样品，使其被荧光基团吸收。当荧光基团吸收一个光子后，被称为处于“激发态”，该吸收过程称为“激发”。当荧光基团以光子形式释放能量时，这一过程称为“发射”，所释放的光子即为荧光。
用于激发荧光基团的光束由显微镜的物镜聚焦，并在“焦点”处达到最紧密的聚焦。在焦点之后，光束再次发散。入射和出射光束可被可视化为在焦点处相接的一对圆锥（见图1，左侧面板）。衍射现象限制了光束能够被聚焦的紧密程度——实际上，光束会聚焦成一个具有有限尺寸的光斑。焦点光斑的大小由两个因素决定：1）光的波长；2）物镜的聚光能力，后者由其数值孔径（NA）来表征。焦点“光斑”不仅在x-y平面上延伸，也在z方向上延伸，实际上是一个焦点体积。该焦点体积的尺寸定义了光学成像所能达到的最高分辨率。尽管光子数量在焦点体积内最大，但在焦点上下方的锥形光路中仍存在较低密度的光子，因此光路中的任何荧光基团都可能被激发。在传统的（宽场）落射荧光显微镜中，来自焦点平面上方和下方荧光基团的发射会产生离焦荧光（“模糊背景”），从而降低图像的分辨率和对比度，如图1所示，其中红色立方体代表位于焦点平面（红色星号）上方的荧光基团发射，导致离焦荧光信号（右上角）。这一问题在共聚焦显微镜中因使用了针孔而得到改善（图2，右下角）。如图3所示，针孔允许来自焦点平面的发射光到达探测器（左图），同时阻挡离焦荧光信号进入探测器（右图），从而提高了分辨率和对比度。
<img alt="共聚焦显微镜与落射荧光显微镜示意图；焦体积比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图1"> 
图1. 落射荧光显微镜与共聚焦显微镜的光学分辨率比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
用于激发荧光分子的光束经显微镜的物镜聚焦后，在焦点体积处汇聚，随后发散（左图）。红色星形代表正在成像的样品的焦平面，而红色方块代表焦平面上方荧光分子的发射光。当使用落射荧光显微镜对该样品成像时，来自离焦区域（红色方块）的发射光将可见，并导致出现“模糊背景”（右上图）。共聚焦显微镜配备一个针孔，可阻止焦平面以外发射的光被检测到，从而消除“模糊背景”（右下图）。
<img alt="共聚焦显微镜示意图，光学激发，激光，针孔探测器，焦点区分。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图1"> 
图2. 共聚焦显微镜中的针孔效应。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
尽管激发光的最高强度位于物镜的焦点处（左侧，红色椭圆），但样品中非焦点区域的部分（右侧，红色星号）也会接收到光线并产生荧光。为了防止这些非焦平面区域发出的光到达检测器，在检测器前方设置了一个带有针孔的屏蔽屏。只有来自焦平面的聚焦光线（左侧）能够穿过针孔并到达检测器，而非焦平面的光线（右侧）则被针孔阻挡，无法到达检测器。
<img alt="共聚焦显微镜激光扫描示意图；光学激发；二向色镜；PMT阵列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图1"> 
图3. 共聚焦激光扫描显微镜的主要组成部分。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为简便起见，共聚焦显微镜的机理描述将仅限于尼康Eclipse Ti A1R型。尽管不同共聚焦显微镜之间可能存在细微的技术差异，A1R仍可作为描述共聚焦显微镜功能的典型模型。由激光二极管阵列产生的激发光束经主二向色镜反射后进入物镜，物镜将光聚焦到待成像的样品上。主二向色镜选择性地反射激发光，同时允许其他波长的光透过。随后，光束到达扫描镜，扫描镜以x-y方式在样品上扫过光束，每次仅照亮一个(x,y)像素点。被照明像素处的荧光染料所发射的荧光由物镜收集，并穿过主二向色镜到达光电倍增管（PMT）阵列。次级二向色镜将发射光引导至相应的PMT。样品对激发光的散射光若返回物镜，则会被主二向色镜反射回样品方向，从而阻止其进入检测光路并到达PMT（见图3）。这使得相对较弱的荧光信号能够在不受激发光散射干扰的情况下被定量检测，因为激发光强度通常比荧光信号高出数个数量级。由于针孔阻挡了焦平面以外的光，到达探测器的光仅来自一个狭窄且选定的z平面。因此，可以从一系列相邻的z平面采集图像；这一系列图像通常称为“z-stack”。通过使用适当的软件，可对z-stack进行处理以生成样品的三维图像。共聚焦显微术的一个显著优势是能够区分染色信号的亚细胞定位。例如，可明确区分细胞膜染色与细胞内染色，而这一点在传统的落射荧光显微镜下极难实现（1, 2, 3）。
样品制备是共聚焦成像中的一个重要环节。光学显微技术的一个优势在于能够灵活地对活细胞或固定细胞进行成像。在尝试获取三维图像时，由于需要采集大量z轴层扫图像，同时维持活细胞的生理状态较为困难，且活细胞及其细胞器存在运动现象，因此通常采用固定细胞进行成像。用于共聚焦荧光成像的细胞固定与染色步骤类似于常规免疫荧光所使用的方法。细胞在培养皿载片或盖玻片上培养后，使用多聚甲醛固定以保存细胞形态。采用牛血清白蛋白、脱脂奶粉或正常血清封闭非特异性抗体结合位点。为保持二抗的特异性，所使用的封闭液不应来源于与一抗相同的物种。随后，细胞与针对目标抗原的一抗在一定条件下孵育。当需要标记多个细胞靶标时，各一抗必须分别来源于不同物种。抗原结合的一抗再与荧光染料偶联的二抗结合。所选用的荧光染料偶联二抗应与共聚焦显微镜中可用的激光激发波长相匹配。在同时观察多个抗原时，所用荧光染料的激发/发射光谱应具有足够差异，以便通过显微分析区分各自的信号。染色完成后，将样品封片用于成像。使用封片介质可防止光漂白和样品脱水。如需要，可选用含有细胞核复染剂（例如DAPI或Hoechst）的封片介质（4）。
在以下实验方案中，转染表达 CD1d 的小鼠成纤维细胞（LCD1 细胞）用识别 CD1d 和 CD107a（LAMP-1）的抗体进行染色。CD1d 是一种主要组织相容性复合物 I 类（MHC I 类）样受体，存在于抗原呈递细胞表面，可呈递脂类抗原。LAMP-1（溶酶体相关膜蛋白-1）是一种跨膜蛋白，主要存在于溶酶体膜中。为了实现有效的抗原呈递，CD1d 会经由低 pH 值的溶酶体区室进行转运，因此本方案中使用 LAMP-1 作为溶酶体区室的标志物。通过使用不同物种来源的抗 CD1d 和抗 LAMP-1 抗体，并结合带有独特荧光染料的二抗，可确定每种蛋白在细胞内的定位，以及 CD1d 是否存在于 LAMP-1 阳性的溶酶体区室中。

在本实验中，表达表面糖蛋白基因 CD1d 的小鼠成纤维细胞经过固定、免疫染色后，使用共聚焦显微镜进行成像。图4展示了采用上述方案获得的代表性图像。A图的上半部分显示了各单通道图像，分别呈现每个单独靶标的染色模式。这些图像由z轴层扫（z-stack）采集的单个层面（切片）构成。右侧面板为细胞核的DAPI染色图像。中间面板显示红色标记的CD1d以及绿色标记的溶酶体标志物LAMP-1。左侧面板为三通道合并后的复合图像。红色与绿色信号重叠区域呈现黄色，表明CD1d与LAMP-1存在共定位。染色结果证实CD1d定位于LAMP-1阳性的内体区室中。此外也存在仅显示单一颜色的区域，表明CD1d或LAMP-1单独存在而未发生共定位。A图的下半部分展示了基于z轴层扫图像重建的细胞三维（3D）渲染图像。
图B展示了以100倍放大倍率获取的z层扫描图像的一个切片，更详细地呈现了这两种蛋白质的表达模式。图像右侧用粉红色框标出的区域显示了由图像中粉红色线指定的x坐标方向的横截面...

来源：Dominique R. Bollino1，Eric A. Legenzov2，Tonya J. Webb1  
1 马里兰大学医学院微生物学与免疫学系，中国台湾

共聚焦荧光显微镜是一种专门用于定位细胞或组织样本中目标蛋白或抗原的成像技术，其原理是用荧光染料标记的抗体对抗原进行标记，并检测产生的荧光信号。该技术通过在物镜焦平面处设置两个针孔，实现了比宽场荧光显微镜更高的空间分辨率，因此得名“共聚焦”。该技术使用户能够在亚细胞水平上观察染色情况，例如区分细胞膜表面染色与细胞内染色。共聚焦显微镜遵循与经典荧光显微镜类似的基本原理。光源（通常为共聚焦显微镜中的激光）发出的光束被二向色镜反射，并通过物镜聚焦到样品上。此光线激发荧光基团发射出不同波长的光，该发射光经物镜和二向色镜返回，最终到达相机或目镜。共聚焦显微镜的分辨率得以提高，主要归因于在激发光路和发射光路中均设有两个针孔，这些针孔是允许光线通过的极小孔径。针孔被战略性地放置在物镜的焦平面上。现在，让我们切换到显微镜结构的侧视示意图，以回顾光路过程。激发光在通过激发针孔后，其效果相当于从一个焦点发出，从而使物镜能够将光线聚焦到样品上的一个对应点。从该焦点发出的发射光束会汇聚于发射针孔处，并得以通过。然而在激发过程中，位于光路中焦点上方和下方的荧光分子也会受到一定程度的激发。虽然来自焦点的发射光能够顺利通过针孔，但来自非焦平面点的发射光则会在发射针孔之前或之后汇聚，因而被阻挡，从而减少了背景荧光信号。需要对兴趣区域中的每个成像点重复进行激发-发射-检测循环，该过程可通过几种不同的方式实现。例如，激光扫描共聚焦显微镜利用检流计扫描镜，将激发光以不同角度偏转，从而在XY平面上扫描光束穿过样品。而转盘共聚焦显微镜则采用带有小孔阵列的转盘，通过旋转改变小孔的位置排列，使得每次可同时照亮样品中多个微小的成像点，并随着转盘旋转逐步覆盖整个区域。由于小孔的存在，探测器处获得的XY图像仅对应一个很窄的Z平面。因此，可以从一系列连续的Z平面采集图像，通常称为Z序列（Z stack）。通过这些图像，合适的软件可重建出样品中荧光信号分布的三维图像。在本实验方案中，您将观察小鼠成纤维细胞的免疫染色，随后在共聚焦显微镜下成像，以区分显示细胞表面蛋白和溶酶体蛋白。首先，采用无菌技术，将目标细胞以每孔500微升培养基重悬，随后接种至四孔细胞培养板的各孔中。本实验中使用的是经转染以表达抗原呈递分子CD1d的小鼠成纤维细胞。为使细胞贴附于玻片表面，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中过夜培养。次日早晨，吸除各孔中的培养基，再用500微升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，持续数秒钟。为固定细胞，向每个孔中加入 500 µL 1% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟。孵育结束后，将多聚甲醛收集至适当的危险液体废物容器中，随后用 PBS 洗涤细胞三次，每次数秒，以去除残留的固定剂。为了使抗体能够进入细胞，向每个孔中加入 500 微升通透缓冲液，在室温下于实验台孵育 15 分钟。通透处理后，用 500 微升 PBS 短暂洗涤细胞三次。接着，向每个孔中加入 500 微升封闭缓冲液，在 4 摄氏度孵育一小时，以防止抗体的非特异性结合。将一抗（抗-CD1d 和抗-LAMP-1）稀释至适当的工作浓度。随后，吸除各孔中的缓冲液，并在每个孔中加入500 µL稀释后的一抗溶液，将载玻片置于4°C的水平面上避光孵育过夜。次日早晨，将二抗（此处为带有不同荧光标记的抗小鼠和抗大鼠抗体）用封闭缓冲液稀释至适当的工作浓度。接着，吸除各孔中的一抗溶液，用500 µL PBS洗涤细胞四次。然后，向每孔加入500 µL稀释后的二抗溶液，在室温下避光孵育一小时。孵育结束后，吸除二抗溶液，并用500 µL PBS洗涤各孔四次，以去除未结合的二抗。最后一次洗涤后进行样品封片时，小心地将腔室从载玻片上拆下并移除。为去除残留的 PBS，将载玻片倾斜置于一张洁净擦拭纸上，从边缘轻轻吸去液体，注意不要触碰细胞。待多余 PBS 去除后，在每部分细胞区域上滴加一滴含核染料 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。接着取一块 20 × 60 毫米的盖玻片，仅用指尖捏住其一侧边缘，缓慢地将其一边先接触封片剂并逐渐放下，注意避免在细胞区域产生气泡。用洁净擦拭纸擦去载玻片上多余的封片剂，将载玻片置于避光环境中室温保存，最多可保存一周。开始对细胞进行成像时，首先点击桌面上的 NIS 软件图标。进入控制窗口后，点击顶部的 TiPad 选项卡，并选择用于成像的合适物镜。然后将载有细胞的玻片放置在载物台上，并将其置于物镜正下方居中。接下来，在 TiPad 选项卡旁边的 A1plus Compact GUI 选项卡中，根据所用荧光染料设置相应的激光器。点击齿轮图标以打开染料与光谱设置菜单。打开染料与光谱设置菜单后，选择所需的通道，并为每个通道设置对应的激光器。随后，在第一个二向色镜下方的下拉菜单中选择适当的发射波长。接着，在 A1plus Compact GUI 窗口中，点击 Ch.Series 以设置线扫描通道序列，该设置决定所用激光器是对样品同时激发还是依次激发。此后，单击顶部的箭头图标开始扫描。此时，在成像实时进行的情况下，在 A1plus Compact GUI 窗口中单击滑动标尺，调整针孔大小，以确保限制非焦平面的杂散光。接下来，使用滑动标尺调节每种激光的高压和偏移设置至适当水平，以便在检测特异性染色的同时尽量减少潜在的背景染色。如果有阳性染色样本可用，应首先对每种通道成像该样本，以确保激光设置获得最佳的信噪比。在为每种激光设定最佳的高压和偏移值后，单击 ND Acquisition 选项卡，然后选择 Z 图标以设置 z 系列的参数。接下来，在获取样品的实时图像时，首先通过找到图像的底部并点击“底部”按钮来设定底部位置。然后，找到样品的顶部位置并点击“顶部”按钮。通过在每个步进中以微米为单位直接输入所需的步进大小，或指定所需的总步数来设置步进尺寸。要选择所需图像的尺寸/像素分辨率，请点击 Aiplus Compact GUI 窗口，在尺寸图标下选择所需的分辨率。为了降低图像噪声，可以选择 theta 符号旁边的下拉菜单，以对选定数量的图像进行平均。之后，点击 ND Acquisition 菜单中的 Run Now 选项卡，以开始对样品进行成像。成像完成后，通过点击文件，然后选择另存为，将图像文件保存为扩展名为 .nd2 的文件。最后，对其他每个样品重复此过程。在本实验中，表达表面糖蛋白基因 CD1d 的小鼠成纤维细胞经固定、免疫染色后，使用共聚焦显微镜进行成像。该图像显示了在 40 倍放大倍数下 Z 轴层扫中的单一层切面，其中 CD1d 染色呈红色。样品同时用溶酶体标志物 LAMP-1 进行共染色，显示为绿色。细胞核染色剂 DAPI 用于显示细胞的细胞核。在一幅将三个不同通道合并的复合图像中，红色和绿色通道重叠的区域呈现黄色，表明 CD1d 与 LAMP-1 在溶酶体中共定位。仅显示单一颜色的区域则表明 CD1d 或 LAMP-1 单独存在，未发生共定位。该图像展示了基于 z 轴层扫描（z-stack）图像重建的细胞三维渲染图，此方法可生成该细胞群的侧视图。下一张图像显示了 z 轴层扫描在 100 倍放大倍数下的一个切片，更详细地展示了这两种蛋白的表达模式。图像右侧的粉红色框线区域显示了图像中粉红色线段所指定的 x 坐标截面，代表粉红线位置的侧视图。类似地，图像底部的蓝色框线区域显示了图像中蓝色线段所指定的 y 坐标截面，代表蓝线位置的前视图。z 轴层扫描图像的三维渲染使用户能够以三维方式观察图像，直观呈现所有的 x、y 和 z 平面，可用于研究细胞内不同区域中多种染色信号的共定位情况。

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共聚焦荧光显微镜:确定小鼠纤维细胞中蛋白质定位的技术

confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

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ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

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Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

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Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

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Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

该系列涵盖了免疫学实验室的许多主要技术，包括免疫细胞的标签和分类。它还演示了免疫细胞和抗体的增殖方法，以及包括ELISA在内的免疫活性的常见测定方法。最后，演示了免疫组织和细胞样本的染色和成像。

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

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