Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

操作概述
用于测量细胞死亡的典型51Cr释放实验包括以下步骤：
<ol>
	<li>首先，用 Na2[51Cr]O4 标记靶细胞，以在实验中将其与效应细胞区分开来。</li>
	<li>在靶细胞标记的同时，收集效应细胞，并利用连续稀释法，在圆底 96 孔检测板中制备一系列浓度递减的效应细胞稀释液。</li>
	<li>靶细胞标记结束后，先对细胞进行洗涤，然后将固定数量的靶细胞加入已含有系列稀释效应细胞的检测板中。</li>
	<li>接着，将靶细胞-效应细胞混合物在一定时间内孵育，以允许效应细胞与靶细胞充分相互作用，介导靶细胞裂解。</li>
	<li>最后，收集培养上清液至离心管中，使用γ计数器定量测定其中的51Cr 含量。</li>
	<li>最终，收集数据并用于计算靶细胞的“特异性细胞裂解百分率”。</li>
</ol>
1. 使用51Cr标记靶细胞
<ol>
	<li>首先，将靶细胞（此处为人类黑色素瘤细胞系 WM793）制备成单细胞悬液。</li>
	<li>为此，先从组织培养瓶中移除培养基。</li>
	<li>然后用 5 mL 的 1× PBS 清洗细胞。</li>
	<li>通过向培养皿中加入 1 mL 胰蛋白酶，作用约 2 分钟，使细胞消化。</li>
	<li>轻轻敲击培养瓶，使细胞从瓶壁上松脱。</li>
	<li>向培养瓶中加入 5 mL RPMI 培养基，并用移液器反复吹打，使细胞完全脱离。</li>
	<li>将细胞悬液收集至 15 mL 圆锥管中，在 1200 rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入 10 mL 培养基，轻轻吹打混匀，使细胞重悬。</li>
	<li>使用血细胞计数板测定细胞浓度。</li>
	<li>将 1×106 个细胞转移至新的 15 mL 圆锥管中。</li>
	<li>在 1200 rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>短暂涡旋振荡管子，使细胞沉淀在残留的少量培养基中重新悬浮。</li>
	<li>向 WM793 靶细胞悬液中直接加入 100 µCi 的 51Cr。 
	注意：应设有专门的实验区域用于处理放射性物质。此外，在所有操作步骤中，均需配备充足的铅屏蔽以安全储存和使用 51Cr，并设置适当的警示标识，标明含 51Cr 样品的存放位置。还需配备带有平板探头的盖革计数器，用于检测实验区域是否存在放射性污染。</li>
	<li>在管壁上贴一小块放射性警示胶带，以标明该管已具有放射性。</li>
	<li>将试管置于带有铅屏蔽的 37°C 培养箱中孵育 1 小时，每隔 15–20 分钟轻轻振荡试管，以促进靶细胞对铬的摄取。</li>
	<li>孵育结束后，用 5 mL 胎牛血清（FBS）清洗靶细胞，以去除未结合的 51Cr。</li>
	<li>在 1200 rpm 条件下离心 5 分钟，将具有放射性的 FBS 洗液倒入适当的放射性废物容器中。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬后，再次用 FBS 洗涤一次。使用盖革计数器检测细胞沉淀中的放射性掺入情况。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全培养基中，调整细胞浓度至 105 个细胞/mL。 
	注意：出于安全考虑，此处省略了 51Cr 标记后的细胞计数步骤。可假设 WM793 细胞浓度与 51Cr 标记前相同。</li>
</ol>
2. 效应细胞的制备
<ol>
	<li>可使用多种效应细胞，例如人或小鼠的T细胞和NK细胞。本示例中，使用通过标准密度梯度离心法从全血中分离得到的外周血单个核细胞（PBMCs，浓度为5×106）。</li>
	<li>开始时，向96孔圆底板的一整行（此处为A行，见表1）每孔加入100 µL组织培养基。此处不添加效应细胞，用于作为空白对照，以测定靶细胞的“最低/自发51Cr释放”。</li>
</ol>
<img alt="显示四种实验条件下细胞释放水平的E:T比热图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图1"> 
表1：51Cr释放实验设计： 第A行：靶细胞（104 个细胞/100 µL）仅与培养基共同孵育（用于测定“空白”值，即“最低/自发性51Cr释放”）。第B至C行：包含不同效应细胞与靶细胞（E:T）比例的孔，比例范围从50:1至1.5:1。第H行：靶细胞（104 个细胞/100 µL）与1% NP-40共同孵育（NP-40可裂解靶细胞，产生“最大或总51Cr释放”）。每种实验条件下，每个E:T比例均设置三个重复孔。第1-3列：未刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）；第4-6列：经CpG刺激的PBMCs。
<ol start="3">
	<li>接下来，对 PBMC 进行 2 倍系列稀释（每种实验条件设三个重复），以获得效应细胞浓度从 5×105 至 15,625 个细胞/100 µL 培养基的稀释梯度（此处为 B 至 G 行）。 
	注意： 本示例中，初始效应细胞:靶细胞（E:T）比例为 50:1。但该比例可根据具体实验条件进行调整。</li>
	<li>最后一行不加入任何效应细胞（此处为 H 行），保持空白（该行将用于生成“总计数/分钟”（c.p.m）或“最大 51Cr 释放量”）。</li>
	<li>将培养板放入 37°C 培养箱中孵育，直至靶细胞准备就绪待加入。</li>
</ol>
3. 将51Cr标记的WM793靶细胞加入检测体系
<ol>
	<li>孵育结束后，将靶细胞从培养箱中取出，加入 5 mL 胎牛血清（FBS）洗涤，以去除多余的 51Cr。</li>
	<li>使用指定的离心机，以 1200 rpm 离心 5 分钟。</li>
	<li>将 FBS 洗涤液（放射性上清）转移至适当的废液容器中。</li>
	<li>通过将细胞沉淀重悬于 5 mL 新鲜 FBS 中，重复洗涤步骤。</li>
	<li>再次以 1200 rpm 离心 5 分钟。</li>
	<li>最后，将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全培养基中。</li>
	<li>将 51Cr 标记的 WM793 细胞悬液（105 个细胞/mL）倒入一次性试剂储液槽中。</li>
	<li>然后使用多通道移液器，向 96 孔效应细胞板的每孔中加入 100 μL 上述标记的靶细胞。</li>
	<li>接下来，向不含效应细胞的孔行（此处为 H 行）加入 100 μL 1% NP-40（溶于水）。1% NP-40 可裂解靶细胞，因此这些孔作为对照，用于测定“总计数/分钟（c. p. m）”或最大 51Cr 释放量。</li>
	<li>通过在板的两侧各贴一小块透气胶带固定板盖，并在盖上贴放射性警示胶带，以标明其含有 51Cr。</li>
	<li>短暂地以 1200 rpm 离心该板。若仅使用一块实验板，需在离心机中加入配平板。 
	注意：必须使用标记为可处理放射性样品的离心机。</li>
	<li>从离心机中取出板。</li>
	<li>将板放入 37°C 培养箱中，并在板上方放置一小块铅屏蔽以增强安全性。孵育 16 小时，以允许靶细胞发生裂解。 
	注意：孵育时间可根据所用效应细胞及其潜在杀伤机制的不同，在 4 至 18 小时之间调整。</li>
</ol>
4. 收集上清液
<ol>
	<li>孵育结束后，小心移除平板边缘的胶带并打开盖子。</li>
	<li>接着将收集架放置在平板上，确保每个棉塞下方的小滤膜圆片均已就位，以保证获得无细胞上清液。</li>
	<li>现在，缓慢而轻柔地将棉塞压入各孔中。</li>
	<li>约10秒后，松开对棉塞的压力，然后将棉塞转移至管条中。</li>
	<li>将每个管子放入一个次级FACS管中。</li>
	<li>最后，将FACS管装载到γ计数器上，运行样品以定量每种条件下释放的51Cr量。通常每份样品测量1分钟，便于直接确定“每分钟计数（counts/minute）”。</li>
	<li>仔细记录管子装入计数器的顺序。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>此处，未刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）被加入前三个孔，而经CpG刺激的PBMCs（CpG ODN，(1 µg/mL) 刺激24小时）被加入第4至6列。参见表2。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>1832</td>
			<td>1986</td>
			<td>1971</td>
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>1677</td>
			<td>1739</td>
			<td>1428</td>
			<td>5454</td>
			<td>5055</td>
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>1638</td>
			<td>1552</td>
			<td>1734</td>
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>1658</td>
			<td>1580</td>
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>1579</td>
			<td>1472</td>
			<td>1483</td>
			<td>2028</td>
			<td>1779</td>
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td>
			<td>1184</td>
			<td>1801</td>
			<td>1654</td>
			<td>1565</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td colspan="2">A1、A2、A3 的平均值 -&gt;</td>
			<td>1164.67</td>
			<td>自发计数每分钟（c.p.m）</td>
			<td></td>
			<td>1058.33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J</td>
			<td colspan="2">B1、B2、B3 的平均值 -&gt;</td>
			<td>1929.67</td>
			<td>9.91%</td>
			<td></td>
			<td>7907.33</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>50:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K</td>
			<td colspan="2">C1、C2、C3 的平均值 -&gt;</td>
			<td>1614.67</td>
			<td>5.83%</td>
			<td></td>
			<td>5259</td>
			<td>53.67%</td>
			<td>25:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L</td>
			<td colspan="2">D1、D2、D3 的平均值 -&gt;</td>
			<td>1641.33</td>
			<td>6.17%</td>
			<td></td>
			<td>3869</td>
			<td>35.91%</td>
			<td>12.5:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M</td>
			<td colspan="2">E1、E2、E3 的平均值 -&gt;</td>
			<td>1525.67</td>
			<td>4.68%</td>
			<td></td>
			<td>2730.33</td>
			<td>21.36%</td>
			<td>6.25:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td colspan="2">F1、F2、F3 的平均值 -&gt;</td>
			<td>1511.33</td>
			<td>4.49%</td>
			<td></td>
			<td>1858.67</td>
			<td>10.22%</td>
			<td>3.12:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O</td>
			<td colspan="2">G1、G2、G3 的平均值 -&gt;</td>
			<td>1278.33</td>
			<td>1.47%</td>
			<td></td>
			<td>1673.33</td>
			<td>7.86%</td>
			<td>1.56:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P</td>
			<td colspan="2">H1、H2、H3 的平均值 -&gt;</td>
			<td>8884.67</td>
			<td>最大计数每分钟（c.p.m）</td>
			<td></td>
			<td>8885.67</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>未刺激的外周血单个核细胞（PBMC）</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CpG 刺激的外周血单个核细胞（PBMC）</td>
			<td>效应细胞与靶细胞比例（E:T 比例）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：51Cr释放实验数据：“每分钟计数”（c. p. m.）的数值、平均c. p. m.值以及计算得到的特异性裂解百分比值。
<ol start="2">
	<li>将收集的数据（每分钟计数，即 c.p.m）按照样本在原始培养板中的排列方式输入电子表格的相应单元格中。</li>
	<li>首先计算三个重复样本的平均值。未刺激的 PBMCs 对应表 2 中的 I3 至 P3 单元格，CpG 刺激的 PBMCs 对应 I6 至 P6 单元格。</li>
	<li>确定平均值后，使用以下公式计算每种条件下的特异性裂解百分比： 
	 
	<img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg" alt="特异性裂解百分比计算公式，显示免疫学实验中实验值与总 c.p.m 值的计算方法" data-altupdatedat="1761830439000"></li>
	<li>针对每种条件计算特异性裂解百分比（未刺激的 PBMCs 对应表 2 中的 J4 至 O4 单元格，CpG 刺激的 PBMCs 对应 J7 至 O7 单元格）。</li>
</ol>

本文所述的实验方法具有较高的灵活性，可根据具体研究问题选择多种效应细胞和靶细胞。例如，可通过使用不同的靶细胞来确定效应细胞的特异性，或通过使用特定蛋白缺陷的细胞或特异性蛋白抑制剂来确定效应细胞杀伤作用的机制。使用51Cr释放实验的一个主要问题是靶细胞可能出现较高的自发释放率。当靶细胞单独培养（不含效应细胞）时，其51Cr的自发释放量理想情况下不应超过靶细胞经裂解后立即释放的总（&#34;最大&#34;）释放量的30%。较高的自发释放率可能源于靶细胞状态不佳，原因可能包括细胞健康状况差（例如细胞系长期培养）或标记时间过长。

细胞死亡检测：细胞毒性能力的铬释放检测

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

来源：Frances V. Sjaastad1,2，Whitney Swanson2,3 和 Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 明尼苏达大学微生物学、免疫学与癌症生物学研究生项目，明尼阿波利斯，明尼苏达州 55455，美国 
2 明尼苏达大学免疫学中心，明尼阿波利斯，明尼苏达州 55455，美国 
3 明尼苏达大学泌尿外科系，明尼阿波利斯，明尼苏达州 55455，美国 
4 明尼苏达大学共济会癌症中心，明尼阿波利斯，明尼苏达州 55455，美国
免疫系统细胞的主要功能之一是清除被病毒感染或已转化为肿瘤细胞的靶细胞。体外检测免疫细胞细胞毒性的实验方法多年来一直是实验室的常规手段。这些检测可用于评估T细胞、NK细胞或其他任何免疫细胞以抗原特异性或非特异性方式杀伤靶细胞的能力。效应细胞表达的死亡配体（如Fas配体或TRAIL）、细胞因子（如IFNγ或TNF）或细胞毒性颗粒（即穿孔素/颗粒酶B）是诱导靶细胞死亡的一些机制。近年来，肿瘤免疫治疗研究迅猛发展，人们日益关注寻找能够增强免疫细胞细胞毒性活性的试剂，以改善患者的治疗效果。相反，某些疾病的特点是免疫细胞的细胞毒性活性过度增强，因此也需要寻找能够抑制此类反应的干预手段。因此，建立一种能够方便地将多种不同效应细胞、靶细胞和/或反应调节因子整合到实验设计中的检测方法，可为快速评估效应细胞的细胞毒能力及/或靶细胞的反应性提供有价值的手段。
这些 体外 检测涉及不同细胞群体的混合，并使用相对较少数量的效应细胞和靶细胞。因此，该检测的一个必要条件是以一种易于检测和定量的方式标记靶细胞，从而使操作者能够确定效应细胞介导的“特异性裂解百分比”。放射性标记——尤其是以 Na251CrO4 形式存在的铬-51（51Cr）——是一种经济、快速且非特异性地标记靶细胞内蛋白质的方法（1）。较短的标记时间和总检测时间减少了靶细胞数量和/或表型发生显著变化的可能性，而这些变化可能会影响检测结果。当靶细胞因效应细胞的细胞毒性作用而丧失膜完整性时，靶细胞内被 51Cr 标记的细胞蛋白会释放到培养上清液中，从而可用于定量分析。与任何在 体外 研究免疫细胞功能的检测方法一样，有许多重要考虑因素需要关注，以提高实验性能。其中最关键的要素之一是使用健康的效应细胞（以获得最大细胞毒性活性）和靶细胞（以获得最大应答性并最小化自发性死亡/51Cr 释放）。效应细胞与靶细胞之间的接触是必需的（因此通常使用圆底96孔板以促进细胞间接触）（2）。最后，数据分析依赖于阳性与阴性对照靶细胞群体的设置。
以下方案将介绍进行标准51Cr释放实验的步骤，用于测定效应细胞群体的细胞毒性能力，尽管目前已开发出使用铕的非放射性替代方法。51Cr是一种强效的γ射线发射体。因此，使用该实验需要接受适当的辐射安全培训、专用的实验空间、γ计数器，并对放射性样品进行妥善处理。
本实验的常规操作步骤如下：1）制备51Cr标记的靶细胞；2）在靶细胞标记的同时，制备效应细胞并加入到培养板中；3）将标记好的靶细胞加入培养板；4）孵育培养板；5）收集上清液；6）在计数器上检测样本后分析数据。样本通常设置三个复孔，取平均值以消除加样过程中可能存在的微小差异。
正确的个人防护装备（PPE）对此项检测至关重要。具体而言，操作人员应穿戴实验服和手套。根据实验室或机构的要求，可能还需佩戴护目镜。在所有操作步骤中，必须配备充足的铅屏蔽设施，以确保51Cr的安全储存和使用。最后，应设有专门用于使用51Cr的实验区域和专用设备，包括标明含51Cr样品存放位置的规范警示标识，以及配备γ射线探头的盖革计数器，用于检测空间内可能的放射性污染。
在本实验中，我们将利用人黑色素瘤细胞系WM793作为模型，通过铬释放实验，检测人外周血单个核细胞（PBMCs）在CpG刺激与未刺激条件下杀伤黑色素瘤细胞的能力。

本示例中，经CpG刺激的效应细胞（图1，黑色圆圈）杀伤靶细胞的效果随着效应细胞与靶细胞比例的增加而增强。在未刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）中（白色圆圈）未观察到这种增强作用，表明CpG刺激是靶细胞裂解增加所必需的。
<img alt="特异性裂解率与效靶比关系图；CpG刺激与未刺激PBMC比较；免疫学实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图1"> 
图1：51Cr 释放实验散点图：人外周血单个核细胞（PBMC）对肿瘤细胞的杀伤活性，分别检测未刺激（空心圆）和经 CpG 刺激后（实心圆）在不同效靶细胞比（E:T 比）条件下（范围从 50...

来源：Frances V. Sjaastad1,2，Whitney Swanson2,3，以及 Thomas S. Griffith1,2,3,4  
1 微生物学、免疫学与癌症生物学研究生项目，...

在本视频中，您将学习如何进行铬释放实验，并测定效应细胞的细胞毒活性。免疫细胞负责识别并清除体内潜在的有害细胞（如癌细胞或病毒感染细胞），这是免疫反应的重要组成部分。多种免疫细胞（如T细胞和NK细胞）具有一种称为细胞毒性的潜能，即能够识别靶细胞并分泌诱导靶细胞蛋白降解、裂解和死亡的蛋白质。定量检测细胞毒性潜能对于评估免疫细胞的活化状态和效应强度至关重要，而铬释放实验是常用于此目的的方法。该方法可使研究人员在不同条件下比较特定类型免疫细胞所诱导的细胞毒性，对于研究癌症免疫治疗及相关免疫性疾病具有重要价值。首先，将靶细胞（如癌细胞）与放射性同位素铬-51共同孵育，使细胞摄取该同位素。随后，将标记了放射性的细胞与分离得到的待研究免疫细胞（亦称为效应细胞）共同培养于圆底96孔板中，以促进两类细胞之间的相互作用。该检测的整体操作流程包括将特定数量的靶细胞与不同浓度的免疫细胞共同孵育，并设置适当的对照组。通过共培养，效应细胞可诱导靶细胞发生凋亡和裂解，导致细胞内的铬-51释放到上清液中。随后，在预先优化的时间点，收集各孔中的含释放铬-51的上清液。由于铬-51具有放射性，会自发发生放射性衰变并释放γ射线。检测板中各孔上清液的γ射线水平可定量反映靶细胞的裂解程度。该指标通过γ计数仪进行测定，进而用于评估免疫细胞的细胞毒活性。首先，将靶细胞（本示例中为人类黑色素瘤细胞系 WM793）制备成单细胞悬液。为此，首先从组织培养瓶中移除培养基，并用 5 毫升 1× PBS 洗涤细胞。倾去 PBS，然后向培养瓶中加入 1 毫升胰蛋白酶，作用约 2 分钟。轻轻拍打培养瓶，使细胞从瓶壁脱落，随后向瓶中加入 5 毫升 RPMI 培养基。用移液器反复吹打培养基以收集细胞，并将此悬液转移至 15 毫升锥形管中。将离心管放入离心机中，以1200 RPM转速离心5分钟。随后，小心移除管中的培养基，注意不要扰动细胞沉淀。轻轻弹击管底以分散细胞沉淀，并向管中加入10毫升培养基。然后，轻柔地反复吹打培养基，使细胞充分重悬。接下来，使用血细胞计数板测定细胞浓度，并将2毫升原始细胞悬液转移至新的15毫升锥形管中。将该管放入离心机，以1200 RPM转速离心5分钟，使细胞沉淀。离心结束后，将多余的培养基倒入废液容器中。短暂涡旋振荡离心管，使细胞沉淀在残留的少量培养基中重新悬浮。接下来，准备使用铬-51，转移至专门用于此类放射性物质的实验区域。在整个操作过程中，应配备充足的铅屏蔽设施，以确保铬-51的安全储存和使用，同时还需设置适当的警示标识，标明含铬-51样品的存放位置。该区域还需配备带有平板探头的盖革计数器，用于检测可能的污染。在做好放射性物质使用的准备工作后，将100微居里的铬-51直接加入靶细胞悬液中。然后，在试管上贴一小段放射性标记胶带，以表明样品和试管现已具有放射性。将试管放入带有铅屏蔽的37摄氏度培养箱中，孵育1小时，每隔15至20分钟轻轻摇动试管一次。在靶细胞标记的同时，制备效应细胞的单细胞悬液。本示例中，采用标准密度梯度离心法从全血中分离人外周血单个核细胞（PBMCs），浓度为5 × 10⁶。将该效应细胞悬液转移至一次性试剂储液槽中，然后取200 µL该悬液加入96孔圆底板B行的每孔中。接着，向该板C至G行的每孔中加入100 µL RPMI培养基。现在，开始对PBMCs进行系列稀释，以获得不同效应细胞数量的梯度。首先，从B行各孔中移取100 µL细胞加入至C行孔中。随后，将C行孔中的细胞转移100 µL至D行，进一步稀释效应细胞。继续进行系列稀释操作。当达到G行时，从各孔中移出100 µL液体，使该行每孔最终体积为100 µL。接下来，在A行各孔中加入100 µL组织培养基，作为靶细胞自发释放铬-51的对照组，此行不应添加任何效应细胞。然后，将培养板放入37°C培养箱中孵育，直至靶细胞准备就绪待加入。孵育结束后，从培养箱中取出靶细胞，加入5毫升FBS洗涤，以去除多余的铬51。随后将离心管放入指定的离心机中，以1200 rpm离心5分钟。将放射性FBS洗涤液转移至适当的废液容器中，并用5毫升新鲜FBS重悬细胞沉淀，重复洗涤步骤。将离心管再次放入指定离心机中，以1200 rpm离心5分钟。弃去第二次洗涤液，使用盖革计数器检测细胞沉淀中是否掺入了放射性。最后，将细胞沉淀重悬于10毫升完全培养基中，将标记了铬51的靶细胞悬液倒入一次性试剂储液槽中。然后，向96孔效应细胞板的每孔中加入100微升上述标记的靶细胞。接着，向H行各孔中加入100微升含1% NP-40的水溶液，以裂解所有靶细胞。这些孔将作为对照，用于测定每分钟总放射性计数（cpm）。现在，培养板已准备就绪，通过在培养板的每一侧贴上一小块胶带固定盖子，并在盖子上贴上放射性标签，以表明其中含有铬51。然后，将培养板放入标有可处理放射性样品的离心机中。如果仅使用一块实验板，则需在离心机中加入一块平衡板。将离心机设置为1200 rpm，并启动至设定转速。达到转速后，停止机器。从离心机中取出培养板。随后，将培养板放入37摄氏度的培养箱中，并在培养板上方放置一小块铅屏蔽以增加安全性。孵育16小时，以使靶细胞裂解。孵育结束后，小心移除培养板边缘的胶带，并取下盖子。接着，将收获架放置在培养板上，确保每个棉塞下方的小滤膜圆片均已就位。然后，缓慢而轻柔地将棉塞压入各孔中。约十秒后，松开对棉塞的压力，随后将棉塞转移至管条中。将每个管条放入次级FACS管中。最后，将FACS管装载到γ计数器上，运行样品以定量每种条件下释放的铬51的量。仔细记录各管在计数器中的装载顺序。在此实验中，前3道加入了未刺激的PBMCs，第4至第6道加入了经CPG刺激的PBMCs。本示例中，每分钟计数（counts per minute）以与原始培养板中样品排布相同的方式输入电子表格的相应单元格，并计算三个复孔的平均值。例如，对于第一个条件，A1、A2和A3单元格的数值在I3单元格中取平均。确定平均值后，可使用以下公式计算每种条件下的特异性裂解百分比。例如，计算效应细胞与靶细胞比例为50:1的未刺激细胞的特异性裂解百分比时，需从实验CPM值（本例中为1129.67）中减去自发释放CPM值（本例中为1164.67）。然后将所得数值除以最大CPM值与自发CPM值之差，再乘以100，即得特异性裂解百分比。该计算需针对每种条件分别进行。随后可将这些数据绘制成图表，以比较效应细胞与靶细胞比例（E:T ratio）与特异性裂解百分比之间的关系，涵盖未刺激PBMCs和CPG刺激PBMCs两组数据。本示例显示，随着效应细胞与靶细胞比例的增加，经CPG刺激的效应细胞对靶细胞的杀伤能力更强；而在未刺激的PBMCs中未观察到此增长趋势，表明CPG刺激是靶细胞裂解增加所必需的。

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Education

教育

JoVE Science Education

Advanced Biology

高级生物学

Immunology

免疫学

细胞死亡测定:细胞毒性能力的铬释放测定

chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

chromium-release-assay-for-immune-cell-killing

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

该系列涵盖了免疫学实验室的许多主要技术，包括免疫细胞的标签和分类。它还演示了免疫细胞和抗体的增殖方法，以及包括ELISA在内的免疫活性的常见测定方法。最后，演示了免疫组织和细胞样本的染色和成像。

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

Description

Transcript