本手术操作演示了将胚胎干细胞来源的内皮细胞递送至缺血后肢的方法，并通过生物发光成像进行无创追踪。
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本文内容
摘要
摘要
外周动脉疾病（PAD）是由向腿部和足部供血的外周动脉狭窄所致，这种病理状况可引起间歇性跛行（行走时疼痛）、疼痛性缺血性溃疡，甚至威胁肢体的坏疽等症状。人们普遍认为，血管内皮（即覆盖所有血管和淋巴管管腔表面的单层内皮细胞）在血管稳态和血管再生中起主导作用。因此，基于干细胞的内皮再生可能是治疗PAD的一种有前景的策略。
在本视频中，我们演示了移植胚胎干细胞（ESC）来源的内皮细胞以治疗作为外周动脉疾病（PAD）模型的单侧后肢缺血，并通过生物发光成像无创追踪细胞归巢与存活情况。将详细介绍细胞递送和成像所用的具体材料与操作步骤。本方案参考了Niiyama等人发表的另一篇文献中关于诱导后肢缺血的方法1。
方案
1. 小鼠胚胎干细胞向内皮细胞的分化
- 将胚胎干细胞（ESCs）分化为内皮细胞的方案在其他地方已有描述，本方案不重点介绍2,3。简而言之，让细胞进行分化，然后通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化表达内皮细胞标志物（如CD31或血管内皮钙黏蛋白[VE-cadherin]）的细胞。
2. 双融合报告基因的构建与慢病毒转导
- 生物发光可用于追踪经基因改造以表达报告基因（如萤火虫荧光素酶，fluc）的细胞。在本应用中，我们的细胞在内源性泛素启动子调控下，同时携带fluc和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）融合基因。为实现细胞改造，可使用本实验室开发的pFU-FG慢病毒载体，该载体包含关键的优化遗传元件，符合生物安全标准并提高转导效率，携带fluc-eGFP融合报告基因，可在细胞分化后实现稳定转导。该融合结构可同时实现移植细胞的生物发光与荧光示踪。病毒颗粒制备、转导及表达报告基因的标记细胞制备流程在其他文献中有详细描述4。
3. 将胚胎干细胞来源的内皮细胞移植至缺血后肢
- 开始实验前，准备一只已建立后肢缺血模型的小鼠用于细胞移植。首先，将小鼠放入麻醉诱导舱中，以1 L/min的流速通入含1–3%异氟烷的100%氧气进行麻醉诱导。
- 将小鼠留在诱导舱内，直至其对外界刺激无反应，然后将动物从诱导舱中取出。
- 接着，将小鼠仰卧位固定于手术台上，并连接持续气流，以1 L/min的流速供给含1–3%异氟烷的100%氧气维持麻醉。
- 用碘伏和酒精交替擦拭后肢皮肤三次，进行消毒。
- 皮肤消毒后，取一百万个由胚胎干细胞（ESC）分化而来的内皮细胞，悬浮于30 μL磷酸盐缓冲液（PBS）中。将细胞悬液吸入28号针头中。
- 待细胞准备就绪后，轻柔提起并伸展后肢，以便更清晰地观察腓肠肌的位置。在肢体伸展状态下，将针头穿过皮肤刺入其下的肌肉组织，注意避免接近骨骼。缓慢而轻柔地将30 μL细胞悬液注射至腓肠肌内。由于30 μL已接近肌肉注射可容纳体积的上限，因此推荐使用28号胰岛素注射器，根据我们的经验，此类注射器可避免针管内液体残留造成的细胞损失。
- 注射完成后，将小鼠放回恢复笼中，并持续监测直至其完全苏醒。让动物恢复数小时后，进行移植细胞的活体生物发光成像分析。
4. 体内 ESC 来源内皮细胞的生物发光成像
- 移植的ESC来源的内皮细胞经修饰后，在内部泛素启动子的调控下表达fluc和eGFP融合基因。因此，可利用生物发光成像技术在缺血后肢中追踪这些细胞。
- 开始此步骤时，打开生物发光成像系统及Living Image采集软件，初始化采集系统，并设定视野尺寸。
- 随后，将哑光黑纸放置于成像箱内，以吸收背景发射光。
- 成像箱准备就绪后，将小鼠放入含有1–3%异氟烷（氧气流速1 L/min）的麻醉诱导舱中，直至其对外界刺激无反应，然后将动物从诱导舱中取出。
- 根据需要使用电动剃毛器去除双侧后肢的毛发。
- 按每克体重10 μL的剂量，向腹腔注射D-荧光素酶底物。D-荧光素酶底物需预先配制成15 mg/mL的PBS过滤储存液。
- 注射荧光素酶底物后，将动物仰卧置于成像箱内的黑纸上方，并连接持续供应的异氟烷气体。
- 将动物放入成像箱并连接异氟烷。
- 开始采集10–60秒的图像，以确定最佳曝光时间，确保图像不饱和。若图像饱和，则缩短曝光时间；若生物发光信号非常微弱，则延长曝光时间。
- 使用最佳曝光时间，每隔1–3分钟持续采集图像，直至信号达到峰值后逐渐衰减。图像采集完成后，保存文件。
- 数据分析时，选择覆盖注射部位的感兴趣区域（ROI）。作为阴性对照，可在未手术侧肢体选择相似的ROI。利用软件测量每个时间点ROI内的总辐射通量，单位为光子/秒/cm2/球面度（p/s/cm2/sr），并采用最大值作为最终数据。数据亦可导出至Excel表格以供后续使用。
- 完成所有数据采集后，将动物放回恢复笼，并持续监测直至其苏醒。
- 重复此操作，以在不同时间点追踪细胞的分布与变化。
- 在预定时间点，可对动物实施安乐死，以评估组织功能。
5. 代表性结果
图1显示了移植细胞在左侧缺血性后肢中的代表性生物发光图像。在采集生物发光信号过程中，信号强度会随时间增加，应以时间过程中获得的最大值作为最终结果进行报告。
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讨论
由于胚胎干细胞（ESCs）具有分化可塑性，并能分化为包括内皮细胞在内的所有三个胚层的细胞谱系，因此在治疗组织缺血方面具有广阔的应用前景。为克服与ESCs相关的伦理问题，诱导性多能干细胞（iPSCs）可能是一种可替代的多能干细胞来源，能够规避伦理争议。除ESCs外，成体干细胞如内皮祖细胞（EPCs）和造血干细胞（HSCs）也可用于治疗，但这些细胞类型在下肢动脉疾病（PAD）患者中的治疗效果可能有限。细胞的肌内注射递送方式具有微创性和操作简便的优点，且该递送方式也适用于可溶性因子或质粒的递送。然而，为了使移植的细胞更易进入血管系统，可采用经股动脉或尾静脉的全身性递送方式，以替代肌内注射。
生物发光成像具有高通量、非侵入性追踪细胞存活的优势。当与激光多普勒血流灌注或新生血管组织学分析等功能性检测方法结合使用时，这些技术可使研究人员全面评估细胞移植对下肢缺血恢复的治疗效果。
综上所述，我们展示了一种简单且可重复的方法，用于递送和追踪胚胎干细胞来源的内皮细胞，以治疗后肢缺血。
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致谢
作者感谢Andrea Axtell、Satoshi Itoh博士、Jeff Velotta博士、Grant Hoyt、Robert C. Robbins博士、Jin Yu博士、Tim Doyle博士以及斯坦福大学小型动物影像中心提供的技术协助。作者还感谢A.M. Bickford, Inc.对兽医设备的支持。本研究得到了美国国立卫生研究院研究基金（R01 HL-75774、R01 CA098303、R21 HL085743、1K12 HL087746）、加州大学加州烟草相关疾病研究项目（15IT-0257和1514RT-0169）以及加州再生医学研究所（RS1-00183）的资助。
N.H. 获得美国心脏协会的奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 手术工具 | 工具 | Fine Science Tools | ||
| 注射器针头 | 工具 | BD Biosciences | 推荐使用 28G 胰岛素注射器 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 试剂 | Invitrogen | ||
| D-荧光素 | 试剂 | Biosynth International, Inc | 提前将 D-荧光素配制为 15 mg/mL 的 PBS 滤过储备液 | |
| IVIS 200 生物发光成像系统及采集软件 | 设备 |  Xenogen Corporation |
参考文献
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