胚胎干细胞来源的内皮细胞用于治疗下肢缺血

摘要

本手术操作演示了将胚胎干细胞来源的内皮细胞递送至缺血后肢的方法，并通过生物发光成像进行无创追踪。

摘要

外周动脉疾病（PAD）是由向腿部和足部供血的外周动脉狭窄所致，这种病理状况可引起间歇性跛行（行走时疼痛）、疼痛性缺血性溃疡，甚至威胁肢体的坏疽等症状。人们普遍认为，血管内皮（即覆盖所有血管和淋巴管管腔表面的单层内皮细胞）在血管稳态和血管再生中起主导作用。因此，基于干细胞的内皮再生可能是治疗PAD的一种有前景的策略。

在本视频中，我们演示了移植胚胎干细胞（ESC）来源的内皮细胞以治疗作为外周动脉疾病（PAD）模型的单侧后肢缺血，并通过生物发光成像无创追踪细胞归巢与存活情况。将详细介绍细胞递送和成像所用的具体材料与操作步骤。本方案参考了Niiyama等人发表的另一篇文献中关于诱导后肢缺血的方法¹。

方案

1. 小鼠胚胎干细胞向内皮细胞的分化

1. 将胚胎干细胞（ESCs）分化为内皮细胞的方案在其他地方已有描述，本方案不重点介绍^2,3。简而言之，让细胞进行分化，然后通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化表达内皮细胞标志物（如CD31或血管内皮钙黏蛋白[VE-cadherin]）的细胞。

2. 双融合报告基因的构建与慢病毒转导

1. 生物发光可用于追踪经基因改造以表达报告基因（如萤火虫荧光素酶，fluc）的细胞。在本应用中，我们的细胞在内源性泛素启动子调控下，同时携带fluc和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）融合基因。为实现细胞改造，可使用本实验室开发的pFU-FG慢病毒载体，该载体包含关键的优化遗传元件，符合生物安全标准并提高转导效率，携带fluc-eGFP融合报告基因，可在细胞分化后实现稳定转导。该融合结构可同时实现移植细胞的生物发光与荧光示踪。病毒颗粒制备、转导及表达报告基因的标记细胞制备流程在其他文献中有详细描述⁴。

3. 将胚胎干细胞来源的内皮细胞移植至缺血后肢

1. 开始实验前，准备一只已建立后肢缺血模型的小鼠用于细胞移植。首先，将小鼠放入麻醉诱导舱中，以1 L/min的流速通入含1–3%异氟烷的100%氧气进行麻醉诱导。
2. 将小鼠留在诱导舱内，直至其对外界刺激无反应，然后....

讨论

由于胚胎干细胞（ESCs）具有分化可塑性，并能分化为包括内皮细胞在内的所有三个胚层的细胞谱系，因此在治疗组织缺血方面具有广阔的应用前景。为克服与ESCs相关的伦理问题，诱导性多能干细胞（iPSCs）可能是一种可替代的多能干细胞来源，能够规避伦理争议。除ESCs外，成体干细胞如内皮祖细胞（EPCs）和造血干细胞（HSCs）也可用于治疗，但这些细胞类型在下肢动脉疾病（PAD）患者中的治疗效果可能有限。细胞的肌内注射递送方式具有微创性和操作简便的优点，且该递送方式也适用于可溶性因子或质粒的递送。然而，为了使移植的细胞更易进入血管系统，可采用经股动脉或尾静脉的全身性递送方式，以替代肌内注射。

生物发光成像具有高通量、非侵入性追踪细胞存活的优势。当与激光多普勒血流灌注或新生血管组织学分析等功能性检测方法结合使用时，这些技术可使研究人员全面评估细胞移植对下肢缺血恢复的治疗效果。

综上所述，我们展示了一种简单且可重复的方法，用于递送和追踪胚胎干细胞来源的内皮细胞，以治疗后肢缺血。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术工具	工具	Fine Science Tools
注射器针头	工具	BD Biosciences		推荐使用 28G 胰岛素注射器
磷酸盐缓冲液	试剂	Invitrogen
D-荧光素	试剂	Biosynth International, Inc		提前将 D-荧光素配制为 15 mg/mL 的 PBS 滤过储备液
IVIS 200 生物发光成像系统及采集软件	设备	Xenogen Corporation