安培电极的制备

摘要

本方案描述了如何制备碳纤维电极。随后可利用这些电极通过碳纤维安培法检测囊泡中儿茶酚胺的释放。

摘要

碳纤维电极对于单细胞囊泡中儿茶酚胺释放的安培法检测至关重要。本文描述了制备低噪声（<0.5 pA）电极所需的技术，这些技术在先前研究者发表的方法（1,2）基础上进行了改进。电极的制备首先通过准备碳纤维，并在真空与滤膜辅助下，将每根纤维单独穿入毛细管中。随后，使用电极拉制仪将含纤维的毛细管拉制，形成两个各具尖端的半电极。接着，将电极浸入加热熔化的环氧树脂与固化剂混合物中，形成环氧-玻璃密封结构。最后，将电极置于烘箱中使环氧树脂固化。在整个过程中，对电极的小心操作至关重要，以确保其制备的一致性并避免损伤。本方案详细展示了用于单细胞记录的安培电极的制备与切割方法。 关键词：碳纤维电极，安培法，单细胞检测，儿茶酚胺释放，电极制备，低噪声电极，环氧-玻璃密封

方案

第一部分：碳纤维制备

1. 剪取一束碳纤维（我们使用直径为7μm的碳纤维），其长度约为毛细移液管长度的1.25倍。
2. 通过将约100 mL丙酮在容器中煮沸，并将碳纤维加入热的沸腾丙酮中处理30分钟或更长时间，以去除纤维表面的上浆剂。
3. 从温热的丙酮中取出纤维，转移至含有50–100 mL新鲜丙酮的洁净烧杯中。
4. 将纤维束置于敞开的150 mm培养皿中，室温下静置过夜，使其自然干燥。

第2部分：火焰抛光玻璃毛细管

1. 用火焰将每根毛细管（我们使用微血细胞比容毛细管，外径1.5 mm，内径1.3 mm，长7.5 cm）进行火焰抛光：用镊子夹住管子中部，将一端置于火焰中，同时在火焰中旋转约3次。
2. 将管子倒置，将另一端放入火焰中，同样旋转3次。
3. 将经过火焰抛光的毛细管放入玻璃培养皿中，并转移至烘箱中，待其准备好用于填充碳纤维时取出。

第3部分：将碳纤维穿入毛细管

1. 参照 Machado 等（2008）和 Mundroff 与 Wightman（2002）的描述，使用连接至带滤膜真空泵的塑料管，将纤维吸入玻璃管中。
2. 使用手术刀切割纤维，使管外留出 ¼ 英寸的纤维长度。

第4部分：在电极拉制仪中拉制移液管-光纤

1. 将毛细管放入电极拉制仪中（我们使用的是日本Narishige型号PP-830），并拧紧旋钮以固定毛细管。
2. 操作开关，执行两次拉制，设置为最佳拉制参数。
3. 当移液管被拉成两半后，用剪刀从中心切断裸露的光纤部分，使两部分分离。
4. 取下每个电极的一半，拉出突出的光纤以打破玻璃密封，再用剪刀修剪光纤，使管外仅保留约1/8英寸的光纤长度。
5. 重复步骤1至4，直至拉制出约16根光纤电极。

第5部分：制备环氧树脂-玻璃封接

1. 在通风橱中，将预装好的环氧树脂分装样品置于设定为 55°C 的加热板上加热 6 分钟。
2. 在环氧树脂加热的同时，用胶带将约 16 根拉制好的电极缠绕成束。
3. Epon 树脂加热 6 分钟后，向热的 Epon 树脂中加入 0.7 克 MPDA（14%，w/v），通过轻轻旋转小瓶混合均匀。
4. 将电极束浸入热的环氧树脂与固化剂混合溶液中。约 20 秒后，足够量的环氧树脂将通过毛细作用进入玻璃尖端。
5. 拆开电极束，将电极放入带槽的纸板上，并将该托盘置于设定为 100°F 的烘箱中。
6. 至少 48 小时后，在解剖显微镜下检查每根电极。丢弃未被环氧树脂填充、尖端压碎、含有多于一根纤维等不合格的电极。检查完每根电极后，将其放回纸板支架中并重新放入烘箱。电极通常在制备后约一个月内可正常使用。

第6部分：切割碳纤维

1. 将碳纤维电极小心地放置在带有聚四氟乙烯胶带的玻璃载片上。
2. 在解剖显微镜下观察电极尖端。
3. 使用洁净的手术刀片垂直切割碳纤维，以获得平整且洁净的表面，便于将碳纤维紧贴细胞放置。

讨论

本方案介绍了如何制备和切割安培电极。在进行安培法记录时，将碳纤维电极置于分泌细胞表面。胞吐活动表现为安培尖峰，反映出儿茶酚胺氧化后电子转移所产生的电化学电流。通过练习制备和切割安培电极，其噪声水平可显著优于许多 commercially available electrodes。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
环氧树脂固化剂 1,3-苯二胺薄片	试剂	Sigma-Aldrich	P23954-100G04 716AJ	分装后应保存在干燥器中，避免光照。
碳纤维	材料	Goodfellow	C005725
微量血细胞比容毛细管	材料	Fisher Scientific	NC9836768
环氧树脂	试剂	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
解剖显微镜	仪器
电极拉制仪	仪器	Narishige International	PP-830	第一次拉制 = 24.8 摄氏度；第二次拉制 = 62.7 摄氏度
烘箱	仪器			设定为 100 华氏度
加热板	仪器			设定为 55 摄氏度