甲型流感病毒核糖核蛋白复合物的纯化与可视化

摘要

甲型流感病毒的基因组由八个独立的RNA和蛋白质复合物组成，称为病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。本文介绍了甲型流感病毒vRNPs的甘油梯度纯化及其透射电子显微镜观察方法。

摘要

甲型流感病毒基因组由八条负链单链RNA分子组成，每条RNA分子均与多个甲型流感核蛋白（NP）拷贝结合，分别包装成病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。这些vRNPs被包裹在病毒包膜内。然而，在病毒进入细胞的过程中，这些vRNP复合物会被释放到细胞质中，并由此进入宿主细胞的核转运系统。为了研究甲型流感vRNPs的核输入过程以及流感病毒基因组的复制机制，使用分离纯化的vRNPs进行实验非常有益，这样可以避免病毒其他组分对相关过程的干扰。本文描述了一种从甲型流感病毒中纯化vRNPs的实验方法。该方法首先使用去垢剂裂解甲型流感病毒颗粒，以释放出vRNP复合物。随后，通过33–70%的不连续甘油梯度速度沉降法，将vRNPs与其他病毒组分分离。收集甘油梯度各组分后，经考马斯亮蓝染色后进行SDS-PAGE分析。合并含有NP蛋白的峰值组分，并通过离心浓缩。浓缩后，采用负染色透射电子显微镜观察vRNPs形态，以验证其结构完整性。本甘油梯度纯化方法是在Kemler方法基础上改进而来的。等(1994)¹，负染色由 Wu 完成等(2007年)²

方案

第一部分：破坏甲型流感病毒颗粒

1. 将750 µl MNT缓冲液（20 mM MES、150 mM NaCl、30 mM Tris，pH 7.5）加入一个Beckman聚碳酸酯离心管（11 mm × 34 mm）中，该离心管专为Beckman Optima Max-E超速离心机的TLA-120.2转子设计。
2. 向该离心管中加入500 µl甲型流感病毒（H3N2 X-31 A/AICHI/68株；2 mg/ml）。通过反复吹打数次，将病毒与MNT缓冲液混匀。
3. 在Beckman Optima Max-E超速离心机中，使用TLA-120.2转子，于4 °C条件下以109,000 × g离心10分钟。
4. 弃去上清液，并将沉淀重悬于500 µl裂解缓冲液（100 mM KCl、5 mM MgCl₂、5% (w/v) 甘油、50 mM 辛基葡萄糖苷、10 mg/ml 溶血卵磷脂、1.5 mM 二硫苏糖醇、100 mM MES，pH 5.5）中。
5. 剧烈涡旋振荡，然后在Eppendorf恒温混匀仪中于31 °C振荡20分钟。

第2部分：甘油梯度沉降速度离心

1. 通过将以下体积的甘油加入贝克曼超清晰离心管（13 mm × 51 mm）中来制备甘油梯度：1 ml 70% (v/v) 甘油、0.75 ml 50% 甘油、0.375 ml 40% 甘油和 1.8 ml 33% 甘油。甘油溶液通过将纯甘油与NM缓冲液（150 mM NaCl，50 mM MES，pH 5.5）混合配制而成。同时制备一支含有甘油和缓冲液的平衡管。
2. 再次涡旋振荡破碎后的病毒样品，并将其加样至甘油梯度上。
3. 在贝克曼MLS-50摆桶转子中，以217,000 × g、4 °C离心3.75小时。
4. 离心结束后，从离心管顶部开始手动收集250 µl的梯度组分。将各组分置于冰上或4 °C保存。

第3部分：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析甘油梯度组分

1. 从每份组分中取出 20 µl 至新离心管中。
2. 加入 5 µl 的 5x SDS-PAGE 上样缓冲液。
3. 在 95 °C 下加热 5 分钟。
4. 短暂离心样品，将样品上样至 10% 聚丙烯酰胺凝胶中，并在其中一个泳道加入分子量标记物。
5. 电泳运行样品，直至溴酚蓝上样染料迁移至凝胶底部附近。
6. 用考马斯亮蓝对凝胶进行染色。

第4部分：vRNP组分的浓缩

1. 选择主要含有核蛋白（NP）的甘油组分，合并后分装至两个Beckman聚碳酸酯离心管（11 mm × 34 mm）中。
2. 用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的超纯水充满每个离心管，并反复吹打数次以充分混匀。
3. 在Beckman TLA-120.2转子中，于4°C条件下以157,000 × g离心4.5小时。
4. 弃去上清液，将沉淀物重悬于50 µl DEPC处理的水中。
5. 如有需要，可测定浓缩vRNP的A₂₈₀值。由于NP是合并组分中的主要成分，可利用其消光系数55,350 M^-1 cm^-1（通过ProtParam³测定）估算NP的摩尔浓度。
6. 将纯化的vRNP分装后于-80 °C冷冻保存，以备后续使用。

第5部分：vRNP的负染色

1. 将1 µl纯化的vRNP加入9 µl新鲜配制并经过两次过滤的MNT缓冲液（20 mM MES、150 mM NaCl、30 mM Tris，pH 7.5）中进行稀释。也可使用其他缓冲液稀释vRNP或洗涤样品载网（步骤5.5），但如果使用醋酸铀进行负染色，则不得使用PBS。
2. 对预先覆盖有火棉胶和碳膜的样品铜网进行辉光放电处理30秒。
3. 用镊子夹住 freshly 辉光放电处理后的样品载网，并在其表面滴加5 µl稀释后的vRNP溶液。
4. 让样品液滴在载网上静置8分钟。
5. 在等待期间，将一小条Parafilm置于实验台面上，分别加入两滴各10 µl的MNT缓冲液（用于洗涤载网），以及一滴80 µl的新鲜配制染色液（1%钼酸铵或1%醋酸铀）于Parafilm上。
6. 吸附8分钟后，用裁成三角形的滤纸从样品载网上吸去部分溶液，注意不要让载网干燥。
7. 将样品载网依次浸入两滴各10 µl的MNT缓冲液中洗涤，总洗涤时间为1分钟。操作时应小心地将载网放入液滴中，再用滤纸吸去部分液体（过程中避免载网干燥）。
8. 在吸去最后一滴缓冲液后，立即将样品载网完全浸入染色液滴中，静置1分钟。
9. 用滤纸将染色液从样品载网上彻底吸干。
10. 将样品载网在空气中干燥数分钟后，即可在透射电子显微镜下观察。

第6部分：代表性结果：

图1

由于甲型流感病毒核蛋白（NP，约56 kDa）是病毒核糖核蛋白复合物中的主要蛋白，因此在含有vRNP的组分中，NP条带通常是最强的条带（图1）。除了NP外，每个甲型流感病毒vRNP还包含一个三聚体RNA聚合酶（分子量分别为82、86和86.5 kDa）复合物。由于这些聚合酶的丰度远低于NP，因此在考马斯亮蓝染色中可能无法观察到。然而，若改用银染对凝胶进行染色，则可检测到这些聚合酶。在NP蛋白洗脱峰所在的组分中，甲型流感病毒基质蛋白M1（约28 kDa）应仅有微量存在。

图2

在透射电子显微镜下观察到的负染vRNP应呈现为杆状颗粒，长度可变，约为30 nm至120 nm（图2a）。寡聚化的NP以NP分子链的形式排列，并进一步折叠成双螺旋重复结构，因此这些杆状颗粒两端有时可见环状结构（图2b）。

讨论

vRNPs 的纯化基于 Kemler 描述的方法 等 (1994).¹ 我们及其他研究者也已采用该方案分离vRNP，以研究其核输入过程。^2,4,5

在操作vRNP时，我们建议使用无RNase的枪头和离心管，因为病毒基因组由RNA组成，因此在RNase存在下容易降解。此外，所有缓冲液均应使用无RNase的水配制。本文所述方案采用酸性提取条件（例如，裂解缓冲液和甘油梯度的pH值为5.5）。类似地，也可进行碱性提取（如Kemler et al. (1994)¹所述），将MES（pH 5.5）替换为Tris（pH 7.8）即可。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
H3N2 X-31 A/AICHI/68 甲型流感病毒	Charles River Laboratories	490715
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
MES	Sigma-Aldrich	M-8250
甘油	Fisher Scientific	G33-1
辛基葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	O-8001
溶血卵磷脂	Sigma-Aldrich	L-4129
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D-9779
考马斯亮蓝 G-250	Kodak	1367796
焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水	Invitrogen	750024
醋酸铀酰	Ted Pella, Inc.	19481
钼酸铵	Fisher Scientific	A-674
Optima MAX-E 超速离心机	Beckman Coulter Inc.	434491
MLS-50 转子组件，摆桶式	Beckman Coulter Inc.	367280
TLA-120.2 转子组件，固定角转子，钛材质	Beckman Coulter Inc.	362046
Eppendorf Thermomixer	Lauda Brinkmann	022670000