甲型流感病毒核糖核蛋白复合物的纯化与可视化

摘要

甲型流感病毒的基因组由八个独立的RNA和蛋白质复合物组成，称为病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。本文介绍了甲型流感病毒vRNPs的甘油梯度纯化及其透射电子显微镜观察方法。

摘要

甲型流感病毒基因组由八条负链单链RNA分子组成，每条RNA分子均与多个甲型流感核蛋白（NP）拷贝结合，分别包装成病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。这些vRNPs被包裹在病毒包膜内。然而，在病毒进入细胞的过程中，这些vRNP复合物会被释放到细胞质中，并由此进入宿主细胞的核转运系统。为了研究甲型流感vRNPs的核输入过程以及流感病毒基因组的复制机制，使用分离纯化的vRNPs进行实验非常有益，这样可以避免病毒其他组分对相关过程的干扰。本文描述了一种从甲型流感病毒中纯化vRNPs的实验方法。该方法首先使用去垢剂裂解甲型流感病毒颗粒，以释放出vRNP复合物。随后，通过33–70%的不连续甘油梯度速度沉降法，将vRNPs与其他病毒组分分离。收集甘油梯度各组分后，经考马斯亮蓝染色后进行SDS-PAGE分析。合并含有NP蛋白的峰值组分，并通过离心浓缩。浓缩后，采用负染色透射电子显微镜观察vRNPs形态，以验证其结构完整性。本甘油梯度纯化方法是在Kemler方法基础上改进而来的。等(1994)¹，负染色由 Wu 完成等(2007年)²

方案

第一部分：破坏甲型流感病毒颗粒

1. 将750 µl MNT缓冲液（20 mM MES、150 mM NaCl、30 mM Tris，pH 7.5）加入一个Beckman聚碳酸酯离心管（11 mm × 34 mm）中，该离心管专为Beckman Optima Max-E超速离心机的TLA-120.2转子设计。
2. 向该离心管中加入500 µl甲型流感病毒（H3N2 X-31 A/AICHI/68株；2 mg/ml）。通过反复吹打数次，将病毒与MNT缓冲液混匀。
3. 在Beckman Optima Max-E超速离心机中，使用TLA-120.2转子，于4 °C条件下以109,000 × g离心10分钟。
4. 弃去上清液，并将沉淀重悬于500 µl裂解缓冲液（100 mM KCl、5 mM MgCl₂、5% (w/v) 甘油、50 mM 辛基葡萄糖苷、10 mg/ml 溶血卵磷脂、1.5 mM 二硫苏糖醇、100 mM MES，pH 5.5）中。
5. 剧烈涡旋振荡，然后在Eppendorf恒温混匀仪中于31 °C振荡20分钟。

第2部分：甘油梯度沉降速度离心

1. 通过将以下体积的甘油加入贝克曼超清晰离心管（13 mm × 51 mm）中来制备甘油梯度：1 ml 70% (v/v) 甘油、0.75 ml 50% 甘油、0.375 ml 40% 甘油和 ....

讨论

vRNPs 的纯化基于 Kemler 描述的方法 等 (1994).¹ 我们及其他研究者也已采用该方案分离vRNP，以研究其核输入过程。^2,4,5

在操作vRNP时，我们建议使用无RNase的枪头和离心管，因为病毒基因组由RNA组成，因此在RNase存在下容易降解。此外，所有缓冲液均应使用无RNase的水配制。本文所述方案采用酸性提取条件（例如，裂解缓冲液和甘油梯度的pH值为5.5）。类似地，也可进行碱性提取（如Kemler et al. (1994)¹所述），将MES（pH 5.5）替换为Tris（pH 7.8）即可。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
H3N2 X-31 A/AICHI/68 甲型流感病毒	Charles River Laboratories	490715
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
MES	Sigma-Aldrich	M-8250
甘油	Fisher Scientific	G33-1
辛基葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	O-8001
溶血卵磷脂	Sigma-Aldrich	L-4129
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D-9779
考马斯亮蓝 G-250	Kodak	1367796
焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水	Invitrogen	750024
醋酸铀酰	Ted Pella, Inc.	19481
钼酸铵	Fisher Scientific	A-674
Optima MAX-E 超速离心机	Beckman Coulter Inc.	434491
MLS-50 转子组件，摆桶式	Beckman Coulter Inc.	367280
TLA-120.2 转子组件，固定角转子，钛材质	Beckman Coulter Inc.	362046
Eppendorf Thermomixer	Lauda Brinkmann	022670000