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甲型流感病毒核糖核蛋白复合物的纯化与可视化

DOI:

10.3791/1105

2009年2月9日

本文内容

摘要

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甲型流感病毒的基因组由八个独立的RNA和蛋白质复合物组成,称为病毒核糖核蛋白复合物(vRNPs)。本文介绍了甲型流感病毒vRNPs的甘油梯度纯化及其透射电子显微镜观察方法。

摘要

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甲型流感病毒基因组由八条负链单链RNA分子组成,每条RNA分子均与多个甲型流感核蛋白(NP)拷贝结合,分别包装成病毒核糖核蛋白复合物(vRNPs)。这些vRNPs被包裹在病毒包膜内。然而,在病毒进入细胞的过程中,这些vRNP复合物会被释放到细胞质中,并由此进入宿主细胞的核转运系统。为了研究甲型流感vRNPs的核输入过程以及流感病毒基因组的复制机制,使用分离纯化的vRNPs进行实验非常有益,这样可以避免病毒其他组分对相关过程的干扰。本文描述了一种从甲型流感病毒中纯化vRNPs的实验方法。该方法首先使用去垢剂裂解甲型流感病毒颗粒,以释放出vRNP复合物。随后,通过33–70%的不连续甘油梯度速度沉降法,将vRNPs与其他病毒组分分离。收集甘油梯度各组分后,经考马斯亮蓝染色后进行SDS-PAGE分析。合并含有NP蛋白的峰值组分,并通过离心浓缩。浓缩后,采用负染色透射电子显微镜观察vRNPs形态,以验证其结构完整性。本甘油梯度纯化方法是在Kemler方法基础上改进而来的。(1994)1,负染色由 Wu 完成(2007年)2

方案

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第一部分:破坏甲型流感病毒颗粒

  1. 将750 µl MNT缓冲液(20 mM MES、150 mM NaCl、30 mM Tris,pH 7.5)加入一个Beckman聚碳酸酯离心管(11 mm × 34 mm)中,该离心管专为Beckman Optima Max-E超速离心机的TLA-120.2转子设计。
  2. 向该离心管中加入500 µl甲型流感病毒(H3N2 X-31 A/AICHI/68株;2 mg/ml)。通过反复吹打数次,将病毒与MNT缓冲液混匀。
  3. 在Beckman Optima Max-E超速离心机中,使用TLA-120.2转子,于4 °C条件下以109,000 × g离心10分钟。
  4. 弃去上清液,并将沉淀重悬于500 µl裂解缓冲液(100 mM KCl、5 mM MgCl2、5% (w/v) 甘油、50 mM 辛基葡萄糖苷、10 mg/ml 溶血卵磷脂、1.5 mM 二硫苏糖醇、100 mM MES,pH 5.5)中。
  5. 剧烈涡旋振荡,然后在Eppendorf恒温混匀仪中于31 °C振荡20分钟。

第2部分:甘油梯度沉降速度离心

  1. 通过将以下体积的甘油加入贝克曼超清晰离心管(13 mm × 51 mm)中来制备甘油梯度:1 ml 70% (v/v) 甘油、0.75 ml 50% 甘油、0.375 ml 40% 甘油和 ....

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讨论

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vRNPs 的纯化基于 Kemler 描述的方法 (1994).1 我们及其他研究者也已采用该方案分离vRNP,以研究其核输入过程。2,4,5

在操作vRNP时,我们建议使用无RNase的枪头和离心管,因为病毒基因组由RNA组成,因此在RNase存在下容易降解。此外,所有缓冲液均应使用无RNase的水配制。本文所述方案采用酸性提取条件(例如,裂解缓冲液和甘油梯度的pH值为5.5)。类似地,也可进行碱性提取(如Kemler et al. (1994)1所述),将MES(pH 5.5)替换为Tris(pH 7.8)即可。

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致谢

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本研究得到了加拿大创新基金会(CFI)、加拿大卫生研究院(CIHR)以及加拿大自然科学与工程研究理事会(NSERC)的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
H3N2 X-31 A/AICHI/68 甲型流感病毒Charles River Laboratories490715
TrisSigma-AldrichT1503
MESSigma-AldrichM-8250
甘油Fisher ScientificG33-1
辛基葡萄糖苷Sigma-AldrichO-8001
溶血卵磷脂Sigma-AldrichL-4129
二硫苏糖醇Sigma-AldrichD-9779
考马斯亮蓝 G-250Kodak1367796
焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水Invitrogen750024
醋酸铀酰Ted Pella, Inc.19481
钼酸铵Fisher ScientificA-674
Optima MAX-E 超速离心机Beckman Coulter Inc.434491
MLS-50 转子组件,摆桶式Beckman Coulter Inc.367280
TLA-120.2 转子组件,固定角转子,钛材质Beckman Coulter Inc.362046
Eppendorf ThermomixerLauda Brinkmann022670000

参考文献

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  1. Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
  2. Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influe....

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