细胞核移植至小鼠卵母细胞

摘要

本视频及实验方案旨在帮助学习核移植技术。

摘要

将体细胞核移植至未受精卵母细胞中，可恢复分化细胞的发育潜能。这表明发育、分化和衰老过程的基础是表观遗传过程，而非遗传过程。这些过程的可逆性为基础研究以及更远期的再生医学带来了令人振奋的前景。在小鼠中，可从克隆的着床前胚胎中分离获得胚胎干细胞。这类胚胎干细胞具有分化为成体生物所有细胞类型的潜能。重要的是，这些细胞在遗传上与供体细胞完全相同。若该技术可应用于人类，则有望从患者体内获得干细胞。这些细胞随后可在体外分化为患者所涉及的特定细胞类型用于研究，或用于替代受损或缺失的细胞。小鼠核移植研究仍然具有重要意义，因其有助于揭示细胞核重编程的基本原理。本视频及配套方案旨在帮助学习小鼠核移植技术，该方法最初由Yanagimachi教授团队建立（WAKAYAMA等，1998）。

方案

准备工作：

1. 有关超数排卵和微滴胚胎培养的详细描述可参见其他文献²。
2. 准备一个培养皿，内含胚胎培养液（例如KSOM，Chemicon）的微滴，用矿物油覆盖（矿物油批次应预先测试其对胚胎培养的兼容性）。在37°C、含5% CO₂的空气环境中平衡（可使用Thermo-Electron 3110水套式培养箱或同等设备）。
3. 准备用于卵母细胞分离的培养皿：在培养皿的一侧放置含HEPES缓冲的CZB液与透明质酸酶（0.1% w/v，Sigma）的液滴，另一侧放置HCZB液滴，均用矿物油覆盖。将培养皿置于解剖显微镜的加热载物台上保温。
4. 准备显微镜：在一个持卵针夹中安装持卵 pipette，其外径约为50µm （略小于卵母细胞直径），尖端开口约20µm。持卵 pipette 可使用拉针仪（Sutter Instruments）和微电极烧制仪（Narishige）等设备自制，也可从Humagen公司购买。 
   
   向显微注射针尾部注入3–5 µL 汞（内径8µm），注意避免汞泄漏。准备一个培养皿，其中放置多个小液滴，分别含11% w/v PVP（聚乙烯吡咯烷酮）溶于HCZB，以及5µg/mL 细胞松弛素B溶于HCZB。 建议使用培养皿的盖子而非皿体本身，因其边缘较短，不会妨碍持卵针和去核针的移动。将持卵针与去核针在HCZB液滴中对齐，并吸取少量HZCB进入持卵针尖端。
5. 供体细胞的制备主要取决于细胞类型及研究者拟进行的实验。通常情况下，供体细胞应使用蛋白酶（如胰蛋白酶）处理，并置于冰上以降低黏附性，直至进行移植操作。
6. 在注射hCG后14–15小时人道处死小鼠。取出输卵管并在温热的含透明质酸酶的HCZB液滴中进行解剖。约5分钟后，卵母细胞将基本脱离颗粒细胞。随后应多次用HCZB洗涤卵母细胞，再转入预先平衡的KSOM微滴中进一步洗涤，并置于培养箱中保存，直至进行去核操作。

去核

操作使用液压显微操作仪（Narishige），在倒置显微镜（如 Nikon TE200）上进行。透明带打孔使用压电显微操作仪（Primetech）。扁平尖端的去核和移植移液管可从 Humagen 公司购买。通过推出微量汞滴以及反复吸入和排出聚乙烯吡咯烷酮（PVP）液滴，清洁并润滑去核移液管。为防止针头粘连，每处理完一组需去核或移植的卵母细胞后，均应重复上述操作。

将少量卵母细胞放入含细胞松弛素B的HCZB液滴中。卵母细胞的数量应根据操作者的熟练程度进行调整。卵母细胞在显微镜载物台上停留的时间不应超过20-30分钟。将操作工具移入含细胞松弛素B的HCZB液滴中。持卵管和去核管应与卵母细胞的赤道面对齐。若持卵管的外径略小于卵母细胞本身，则可实现此对齐。旋转卵母细胞，直至观察到折射率不同的中期纺锤体。若初学者无法观察到纺锤体，可使用DNA染料 Hoechst 配合紫外光照进行定位，但该方法会影响胚胎的高效发育。将中期纺锤体定位在3点钟位置，并用持卵管牢固固定。施加压电脉冲以穿透透明带。用去核管接触中期板。当感觉到中期纺锤体的阻力时，吸出纺锤体并撤回针头。卵母细胞的胞质呈流体状态，但中期纺锤体在被移液管接触时会以团块形式移动。应尽量减少随纺锤体一同吸出的胞质量。完成一批卵母细胞的去核操作后，将其通过胚胎培养液洗涤，并转移至培养箱中等待后续操作。部分去核后的卵母细胞不应进行移植，而应予以激活，作为去核效果的对照。这些卵母细胞将在数小时内发生碎裂，表明去核成功。

核移植

将细胞放入PVP溶液（11% PVP溶于HCZB中）。如果大量克隆在1细胞阶段停滞，应将PVP浓度降低至5%或更低。充分混匀细胞与PVP溶液。使用内径略小于细胞直径的移液枪吸取细胞。吸液时应使细胞膜破裂。在某些情况下，可反复吹打并结合轻微的压电脉冲以破坏供体细胞。每次转移一组卵母细胞时，应使用新制备的一滴供体细胞，因为供体细胞放置一段时间后会变得粘稠。在细胞膜破裂后应尽快注射破碎的供体细胞。进行移植时，应聚焦于卵母细胞本身的赤道面，而非透明带的赤道面，并将移植针和持卵针置于同一平面上。牢固地夹持卵母细胞及其部分胞质。利用压电脉冲穿透透明带。将供体细胞核移至移液针尖端，然后将针尖几乎推至去核卵母细胞的对侧，靠近持卵针的位置，从而在卵母细胞内形成一条深的皱褶。将极少量卵母细胞胞质吸入移液针内，施加一次微弱的压电脉冲以破裂卵母细胞膜，随后排出供体细胞核，在皱褶末端的胞质膜处一边快速回撤针头一边进行吸液。通过同步回撤针头并吸液，应可闭合核移植（NT）后留下的孔洞。这种“闭孔技术”可减少NT过程中卵母细胞裂解的数量。用KSOM洗涤重构后的卵母细胞，并将其放回培养箱中孵育1–3小时。

卵母细胞激活

将培养皿的一半区域滴加无钙MCZB液滴，另一半区域滴加含有10 mM Sr²⁺和5µg/ml细胞松弛素B的无钙MCZB液滴，以抑制极体排出。在5% CO²空气中平衡30分钟。将核移植胚胎充分洗涤于无钙MCZB中，然后分组放入不同的无钙MCZB液滴中。 将培养皿放回培养箱中，培养5–6小时。为对照人工激活程序及胚胎培养条件，应使用未去核的卵母细胞，这些卵母细胞将发育为孤雌胚胎。激活后，将胚胎经KSOM液洗涤，转入培养箱进行长期培养。此时应可见原核形成，表明核移植成功。

胚胎培养基配方手册

母盐

在无菌的1 L容器中加入980 mL超纯H₂O

加入干燥组分：

氯化钠（NaCl）                              4760 毫克（81 毫摩尔）                        西格玛 S-5886
氯化钾（KCl）                                360 毫克（5 毫摩尔）                           西格玛 P-5405
七水合硫酸镁（MgSO₄ • 7H₂O）                290 毫克（1.18 毫摩尔）                       西格玛 M-2773
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）                          160 毫克（1.17 毫摩尔）                      西格玛 P-5655
乙二胺四乙酸二钠（EDTA 2NA）                       40 毫克（0.1 毫摩尔）                          西格玛 E-6635
D-葡萄糖（Glucose (D)）                    1000 毫克（5.5 毫摩尔）                      西格玛 G-6152
 

加入液体组分

乳酸钠（乳酸）                     5.3 mL                         Sigma 44263
青霉素-链霉素溶液（Pen’Strep）                                      10 mL                          Gibco 15140-122

MCZB 储备盐溶液的配制：

将500 mL母盐溶液过滤除菌 （可保存3-4个月；4°C保存）

 

HCZB 储备盐溶液的配制：

从500 mL母盐溶液开始

加入 50 mg 聚乙烯醇（冷溶性；Sigma P-8136）

搅拌30-60分钟，无菌过滤（可保存3个月，4°C储存）

 

无 Ca⁺⁺ MCZB（用于在 5% CO₂ 环境下激活卵母细胞）

从99 mL MCZB储备盐溶液开始

加入干燥组分：

NaHCO₃                                               211 mg                     Sigma S-5761
 
丙酮酸钠（丙酮酸）                     3 mg                         Sigma P-4562
 
L-谷氨酰胺                                        15 mg                         Sigma G-8540
 
牛血清白蛋白（BSA）                 500 mg                      Sigma A-3311

轻轻混匀直至所有组分完全溶解；经无菌滤器过滤。

 

HCZB （用于常温常压环境下的显微操作）

从99 mL HCZB储备盐溶液开始

加入干燥组分：

Hepes-Na                             520 mg                     Sigma H-3784
 
NaHCO₃                               42 mg                       Sigma S-5761
 

加入液体组分：

 

128 mM CaCl₂  （18.8 g/L）                      1 mL                                   Sigma C-7902

 

用 1 N HCl 将 pH 值调至 7.5

搅拌至溶解；无菌过滤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞松弛素B	Sigma-Aldrich		100倍储存液 = 500 µg/ml 细胞松弛素B溶于DMSO中。储存于-20 ˚C。
氯化锶			10倍储存液 = 100 mM SrCl2 溶于H2O中。室温储存。
MCZB储存盐溶液			将500 ml母盐溶液过滤除菌（可保存3-4个月；储存于4 ˚C）
HCZB储存盐溶液			取500 mL母盐溶液，加入50 mg PVA，搅拌30-60分钟，然后过滤除菌（可保存3个月；储存于4 ˚C）。
PVA	Sigma-Aldrich	P-8136	冷溶性
含11% w/v PVP的HCZB溶液			取20 ml HCZB培养基置于50 ml锥形管中，将22 g PVP置于液体表面，盖紧管盖，在4 ˚C静置72 – 96小时，直至PVP完全溶解。使用8 mm滤器过滤除菌后，储存于4 ˚C。
PVP	ICN Biomedicals		分子量 360,000
请在实验方案部分查看其他缓冲液的组成。