细胞核移植至小鼠卵母细胞

摘要

本视频及实验方案旨在帮助学习核移植技术。

摘要

将体细胞核移植至未受精卵母细胞中，可恢复分化细胞的发育潜能。这表明发育、分化和衰老过程的基础是表观遗传过程，而非遗传过程。这些过程的可逆性为基础研究以及更远期的再生医学带来了令人振奋的前景。在小鼠中，可从克隆的着床前胚胎中分离获得胚胎干细胞。这类胚胎干细胞具有分化为成体生物所有细胞类型的潜能。重要的是，这些细胞在遗传上与供体细胞完全相同。若该技术可应用于人类，则有望从患者体内获得干细胞。这些细胞随后可在体外分化为患者所涉及的特定细胞类型用于研究，或用于替代受损或缺失的细胞。小鼠核移植研究仍然具有重要意义，因其有助于揭示细胞核重编程的基本原理。本视频及配套方案旨在帮助学习小鼠核移植技术，该方法最初由Yanagimachi教授团队建立（WAKAYAMA等，1998）。

方案

准备工作：

1. 有关超数排卵和微滴胚胎培养的详细描述可参见其他文献²。
2. 准备一个培养皿，内含胚胎培养液（例如KSOM，Chemicon）的微滴，用矿物油覆盖（矿物油批次应预先测试其对胚胎培养的兼容性）。在37°C、含5% CO₂的空气环境中平衡（可使用Thermo-Electron 3110水套式培养箱或同等设备）。
3. 准备用于卵母细胞分离的培养皿：在培养皿的一侧放置含HEPES缓冲的CZB液与透明质酸酶（0.1% w/v，Sigma）的液滴，另一侧放置HCZB液滴，均用矿物油覆盖。将培养皿置于解剖显微镜的加热载物台上保温。
4. 准备显微镜：在一个持卵针夹中安装持卵 pipette，其外径约为50µm （略小于卵母细胞直径），尖端开口约20µm。持卵 pipette 可使用拉针仪（Sutter Instruments）和微电极烧制仪（Narishige）等设备自制，也可从Humagen公司购买。 
   
   向显微注射针尾部注入3–5 µL 汞（内径8µm），注意避免汞泄漏。准备一个培养皿，其中放置多个小液滴，分别含11% w/v PVP（聚乙烯吡咯烷酮）溶于HCZB，以及5

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞松弛素B	Sigma-Aldrich		100倍储存液 = 500 µg/ml 细胞松弛素B溶于DMSO中。储存于-20 ˚C。
氯化锶			10倍储存液 = 100 mM SrCl2 溶于H2O中。室温储存。
MCZB储存盐溶液			将500 ml母盐溶液过滤除菌（可保存3-4个月；储存于4 ˚C）
HCZB储存盐溶液			取500 mL母盐溶液，加入50 mg PVA，搅拌30-60分钟，然后过滤除菌（可保存3个月；储存于4 ˚C）。
PVA	Sigma-Aldrich	P-8136	冷溶性
含11% w/v PVP的HCZB溶液			取20 ml HCZB培养基置于50 ml锥形管中，将22 g PVP置于液体表面，盖紧管盖，在4 ˚C静置72 – 96小时，直至PVP完全溶解。使用8 mm滤器过滤除菌后，储存于4 ˚C。
PVP	ICN Biomedicals		分子量 360,000
请在实验方案部分查看其他缓冲液的组成。