测量芽殖酵母的复制寿命

摘要

本文介绍了一种测定酵母母细胞复制寿命的通用实验方案。

摘要

衰老是一种退行性过程，其特征是细胞组分和细胞器进行性退化，最终导致死亡。芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae已被广泛用于研究衰老生物学，且已在包括线虫、果蝇和小鼠在内的多细胞真核生物中发现若干酵母寿命决定因子具有保守性¹. 由于缺乏易于量化的与年龄相关的表型，酵母衰老的研究几乎完全依赖于在不同条件下测量细胞的寿命，目前常用两种不同的寿命研究范式². 时序寿命是指母细胞在非分裂、类似静止状态下的存活时间，被认为可作为多细胞真核生物中终末分化细胞衰老过程的模型。相比之下，复制寿命指的是母细胞在衰老前产生的子代细胞数量，被认为可为有丝分裂活跃细胞的衰老提供模型。本文介绍一种通用的测定芽殖酵母母细胞复制寿命的实验方案。复制寿命测定的目的是确定每个母细胞出芽的次数。通过标准光学显微镜（总放大倍数160倍），如蔡司Axioscope 40或性能相当的其他型号，有经验的研究人员可轻松区分母细胞与子细胞。利用配备光纤针的手动显微操作仪可实现子细胞与母细胞的物理分离。典型的实验室酵母菌株每个母细胞可产生20-30个子细胞，完成一次寿命实验通常需要2-3周。

方案

第1部分：为复制性寿命分析准备菌株和培养皿

本部分介绍了用于复制性寿命实验的固体YEPD平板的制备，以及用于寿命分析的酵母细胞的准备。

1. 采用适当的无菌技术，制备用于培养酵母细胞及进行复制性寿命分析的 YEPD 琼脂平板（1% 酵母提取物，2% 胰蛋白胨，2% 琼脂，2% 葡萄糖）。在寿命实验中，每分析 4–5 株菌株应至少准备 2 块平板。平板应在寿命实验开始前至少 2 天制备，并在实验开始前使其充分干燥。若实验在倒平板后 4–5 天内无法启动，则应将平板置于冷藏培养箱中，并用封口膜或塑料膜包裹，以防脱水。
2. 从冷冻保藏菌种中取出酵母菌株，并在 YEPD 琼脂平板上划线以获得单菌落。通过将平板均分为若干等大的扇形区域，可在同一块 YEPD 平板上轻松划线接种最多 6 株菌株。
3. 将细胞在 30°C 下培养 2 天。
4. 从培养箱中取出平板，挑取单菌落中的细胞，并将其转接到一块新的 YEPD 平板上进行点种。每株菌应从两个不同的单菌落中分别进行两次点种。此时应对待分析的菌株进行编码，以确保复制性寿命实验以“盲法”方式进行，即操作人员在实验过程中不知晓各菌株的具体身份。
5. 将已点种并编码的细胞在 30°C 下继续培养，直至次日晚上。
6. 取出细胞，将每株编码菌株的细胞轻轻点种至新的 YEPD 平板上，这些平板将作为复制性寿命分析的实验平板。细胞应沿 YEPD 平板左侧的垂直线进行点种（图 1）。每块平板点种 3–5 个点为宜，假设每个点中分析 20 个细胞的复制性寿命。无需（也不建议）转移大量细胞至新的 YEPD 平板，因为这会导致细胞在过夜培养期间生长过密，可能影响其后续的复制性寿命。
7. 将新点种的平板在室温下过夜培养。

第二部分：为复制性寿命分析定位细胞。

本部分将介绍如何将酵母细胞放置在培养皿上，以及如何获得初生子代细胞用于复制性寿命分析。从此时起，所有培养皿均应用封口膜密封，仅在进行显微解剖时打开，以防止干燥。

1. 使用配备有适用于酵母的显微切割装置的显微镜，将第一个划线菌株的约50个细胞转移至平板上距离划线菌落较远的位置。如果显微镜载物台带有刻度，可利用这些刻度确保在后续操作中易于找到细胞。在Zeiss Axioscope 40显微镜上，可将第一个划线菌株的细胞置于坐标90 × 10处，并从此位置开始垂直排列。
2. 用针尖反复接触琼脂表面以清除其上的细胞，然后将针尖用力穿过琼脂表面制造一个小孔。该小孔将作为标记，用于在后续的解剖和子细胞移除操作中定位培养皿上的位置。注意避免将酵母细胞带入小孔中，否则细胞会生长并形成菌落。
3. 在孔的正上方，将单个酵母细胞垂直排列成20个等间距的位置，间距为1-3根针直径（约100 μM）每个细胞位置之间（图1）。每隔几个细胞，将两个细胞并列放置在行中的同一位置，而不是一个细胞。这样可以在挑选未交配的子代细胞时提供冗余性，以防转移的细胞中有一个无法分裂。
4. 10 之间^th 和 11^th 在划线位置于琼脂上创建一排7-8个水平排列的小孔，作为标记，以便在后续解剖和子细胞移除操作中确定培养皿上的方位。注意避免将酵母细胞带入小孔中，否则细胞会生长并形成菌落。
5. 对平板上的每个菌斑重复步骤 2.1–2.4，继续沿同一轴线垂直排列细胞。在步骤 2.2 中，所创建的孔数应与菌斑序号相对应（第一个菌斑打一个孔，第二个菌斑打两个孔，依此类推）。
6. 细胞在每个微阵列区域加样后，用封口膜封板并在指定条件下孵育 30°C 约2小时。
7. 对实验中的每一块培养板重复步骤 2.1–2.6。

第3部分：获取用于寿命分析的子代初孵细胞

在本部分中，我们通过确保每个细胞均起始于一个新生的女儿细胞，来启动寿命分析。

1. 从培养箱中取出培养板，检查大多数阵列细胞是否已完成一次细胞分裂。如果需要更多时间以完成细胞分裂，请将培养板重新放回培养箱中继续培养。
2. 从第一个阵列细胞开始，使用显微操作针轻轻将针尖置于贴壁细胞上方，以分离子代细胞与母细胞。有时在针尖接触细胞时轻敲显微镜底座侧面会有所帮助。
3. 将分离出的子代细胞放置在垂直线上，取代原来的母细胞及其他额外的子代细胞，并将这些细胞暂时移至一旁。
4. 对每一个阵列细胞重复步骤 3.2 和 3.3。如果某个细胞未能分裂，可从步骤 2.3 中预留的冗余细胞中取一个子代细胞替代。操作完成后，每一块寿命分析板上的每个菌落应垂直排列有 20 个子代细胞。
5. 将所有母细胞及多余的子代细胞收集成堆，并转移回靠近菌落的区域（“墓地”）。重要的是，必须将不需要的细胞远离正在进行寿命分析的细胞，以防止微菌落形成以及局部营养耗尽。
6. 用封口膜封好培养板，于 30°C 下培养约 2 小时。
7. 对实验中的每一块培养板重复执行步骤 3.2 至 3.6。

第4部分：测量单个细胞的复制能力

1. 准备寿命数据记录表。寿命数据表可以是一个简单的网格，其中每一行对应一个母细胞，每一列对应一个年龄时间点（图2）。根据待分析菌株的数量为每张数据表标注标签。
2. 从培养箱中取出培养板，检查大多数排列的细胞是否已完成至少一次细胞分裂。如果需要更多时间以完成细胞分裂，请将培养板重新放回培养箱中继续培养。
3. 从第一块板上的第一个排列细胞开始，通过显微镜观察母细胞及其子代细胞（们），并确定已发生的细胞分裂次数。通常可根据细胞排列的特征模式，较容易地判断母细胞产生了多少个子代细胞。将母细胞产生的子代细胞数量记录在寿命评分表的相应位置。
4. 使用针具将子代细胞从母细胞上分离，操作方法如步骤3.2所述。
5. 将母细胞保留在其垂直排列的原始位置，将子代细胞暂时移开。
6. 对每一块板上的所有排列细胞重复执行步骤4.3至4.5。
7. 收集所有已弃置的子代细胞，并将其移至“墓地”区域，该区域位于原始菌斑附近。
8. 用封口膜（Parafilm）密封培养板，并在30°C条件下培养2–3小时。
9. 对实验中的每一块培养板重复执行步骤4.3至4.8。
10. 重复执行步骤4.2至4.9，直至所有母细胞停止分裂。随着母细胞老化，细胞周期进程会逐渐变慢，因此在不同年龄时间点之间，宜延长培养板的孵育时间。培养板可在4°C条件下过夜保存。

第5部分：代表性结果。

复制性寿命实验产生的原始数据是一组数字列表，对应每个母细胞在各个年龄点产生的子代细胞数量（图2）。通过将记分表中每一行的数值相加，可得到每个母细胞的复制性寿命。来自同一实验组的母细胞数据可以合并，用于生成生存曲线（图3A），并进行统计学计算，如平均寿命、中位寿命和标准差。可采用非参数检验方法（如Wilcoxon秩和检验）来判断不同实验组之间的寿命差异是否具有显著性。当实验正常进行时，生存曲线应大致符合Gompertz-Makeham动力学特征，呈现为S形曲线：早期死亡率较低，随后生存率相对较快下降，到较晚年龄时曲线趋于平缓。大多数野生型菌株的复制性寿命范围在20至30代之间，尽管已有文献报道存在超出此范围的变异情况。

图1. 典型的复制性寿命平板示意图。在开始酵母细胞显微分离的前一晚，将3-5个菌株轻轻点种于YEPD平板表面（红色方框），沿平板一侧垂直排列。经过一夜生长后，从每个菌株中挑选约30个单个细胞，垂直排列成包含20个位置的列。寿命分析将基于这些初始细胞产生的新生子代细胞进行。实验过程中显微分离获得的多余细胞（例如不需要的子代细胞）将被放置于“墓地”（灰色椭圆区域），该区域远离实验细胞，以避免菌落形成过程中局部营养耗竭。

图2. 复制性寿命计数表。 显示了复制性寿命实验的原始数据。每一行对应一个酵母母细胞，每一列对应一个年龄时间点。每个方框中填写的数字表示该母细胞在该年龄时间点产生的子代细胞数量。每种菌株均以编码数字标记，以确保进行酵母细胞分离的操作者不了解所分析菌株的身份信息。每种菌株检测20个细胞。

图3. 复制性寿命实验中典型的存活曲线与生长曲线。 （A）存活曲线通过绘制仍存活的母细胞比例随复制年龄（细胞分裂次数）的变化获得。（B）生长曲线通过绘制特定菌株在不同年龄时间点产生的子代细胞平均数量获得。在此示例中，菌株#2寿命更长，但生长较慢，这由生长曲线初始斜率较低可证。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	试剂	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
蛋白胨	试剂	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
酵母提取物	试剂	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
葡萄糖