通过乳腺成像窗口对Dendra2标记的肿瘤细胞进行活体光转换和追踪，是一种能够在数天时间尺度上对特定肿瘤微环境中的肿瘤细胞转移行为进行成像的技术。
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摘要
摘要
在过去的十年中，对小鼠和大鼠乳腺肿瘤的单细胞分辨率活体显微成像1-4已为肿瘤细胞的转移行为机制（如迁移、侵袭和内渗）提供了重要的研究见解5, 6, 血管生成3以及免疫细胞的反应7-9. 我们最近报道了一种在活体小鼠中对原位乳腺癌进行多次活体成像的技术10为此，我们开发了一种乳腺成像窗（Mammary Imaging Window, MIW），并优化了Dendra2的成像参数11光开关与成像in vivo. 此处，我们描述了制造显微成像窗（MIW）、将MIW植入肿瘤表面以及使用定制成像盒对Dendra2标记的肿瘤细胞进行成像的实验方案。该方案可用于在不同肿瘤微环境中观察肿瘤细胞的转移行为，并实现对血管、肿瘤细胞及宿主细胞的长期成像。
方案
1. 通过将肿瘤细胞注射到乳腺脂肪垫中生成荧光肿瘤：
- 将表达 Dendra2 蛋白（作为细胞质标记物）的细胞系培养至 40 - 80% 汇合度。
- 用不含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS 至少冲洗培养皿 3 次。
- 每 10 cm 培养皿中加入 3 ml 胰蛋白酶，37 °C 孵育直至大多数细胞脱落，然后将培养皿撞击平坦表面以振落细胞。
- 将所有细胞从培养皿上冲洗下来，同时使用刮刀（橡胶刮铲）收集基质成分。 加入 5 ml PBS。 在离心过程中取部分样品进行细胞计数。
- 以 800 g 离心 5 分钟。
- 吸除上清，用 PBS 重悬细胞至浓度为 5–10×106/ml。 冰上保存，并在 30 分钟内完成注射。
- 将装有 4–5 周龄雌性免疫缺陷小鼠（例如 SCID 小鼠）的笼子放入无菌操作台内。
- 用 70% 乙醇喷洒第 4 对（腹部）乳头周围区域。
- 向乳腺脂肪垫内注射 0.1 ml 细胞悬液。若有助手协助，一人可固定小鼠，另一人将针头插入乳腺脂肪垫。若独自操作，可使用异氟烷对小鼠实施轻度麻醉后再进行注射。
- 当肿瘤生长至 5–7 mm 时，应植入乳腺成像窗（MIW）。
注意：对于某些实验应用，也可先在健康的乳腺脂肪垫上植入 MIW，之后再注射细胞。该方法可实现对瞬时转染细胞在生理环境中的成像观察。
2. 乳腺成像窗（MIW）的手工制作：
- MIWs（图1A）由组织级塑料制成，以确保生物相容性。手动构建时，我们使用5或10 cm的培养皿。
- 戴上乳胶手套。
- 加热一个组织培养皿，并通过将一个圆润坚硬的物体压在加热后的培养皿上来形成曲面（我们使用1英寸的Dremel钻头进行此操作）。
- 使用加热的剃须刀片切下培养皿的中心部分。
- 使用小型锥形Dremel钻头在穹顶状塑料基座的中心钻一个孔（直径为6-7 mm）。
- 使用Dremel工具打磨并进一步修整，使塑料基座的边缘完全光滑。
- 修整塑料基座的顶部，形成一个用于放置玻璃盖玻片的平坦表面。修整后的平坦表面直径应为9-10 mm。
- 使用瞬间胶（氰基丙烯酸酯粘合剂）将8 mm圆形玻璃盖玻片（1号）粘在已平整的表面上。
- 等待胶水完全干燥（15分钟）。
- 使用加热的26G针头从外部（即玻璃所在侧）向基座内部穿刺，制作八个缝合孔。孔应均匀分布在盖玻片周围，距离盖玻片边缘0.5-1 mm。
- 使用5-0缝合针扩大这些孔。
- 在塑料基座上穿刺孔会导致内表面不平整。使用砂纸将该表面彻底打磨光滑。
- 更换手套，并使用小刷子清除MIW上的微小塑料颗粒。
- 用去离子水清洗MIW。
- 使用70%乙醇清洗MIW。用棉签清洁玻璃，使其完全透明。如果胶水蒸气导致出现雾状斑点，可小心使用蘸有丙酮的棉签进行清洁。
- 通过紫外线照射对MIW进行灭菌，每侧照射3小时。
乳腺成像窗（MIW）的半手动制备：
为了制备塑料基底，我们目前使用通过手工制作的MIW制成的硅橡胶铸造模具。该模具由两部分硅橡胶组成，当注入聚酯树脂并立即粘合后，可精确复制原始样品的正面和背面。 液态聚酯树脂按9:10的比例混合，完全固化后（48小时）形成坚硬结构。该塑料具有抗紫外线性能，可长期保存，不会降解或随时间变黄。
基底固化后，后续步骤2.8–2.16与手工制作MIW的方法相同。
3. MIW 的插入：
- 4 周岁左右的区域th 注射肿瘤细胞后数天至数周内，具体时间取决于细胞类型，乳头应出现直径约5-7 mm的小肿瘤（图1B）。表达Dendra2光转换蛋白或其他荧光蛋白的细胞注射后所需观察时间，取决于所使用的细胞系。肿瘤不应出现明显坏死，表面皮肤应保持完整，并有毛发生长。出现坏死性肿瘤的小鼠应实施安乐死。
- 准备无菌手术区域——在无菌操作台内铺一张无菌布，在中央放置一块无菌纱布，周围摆放若干显微器械（MIWs）和无菌手术器械：包括小型标准剪刀、弹簧剪刀、显微解剖镊、显微持钳、持针器。在操作台角落放置无菌棉签、一瓶70%乙醇和无菌手套。
- 小鼠在无菌操作台内通过腹腔注射2.5%阿维丁（20 μl/g，溶于HBSS）进行麻醉，或 alternatively 使用10 μg/kg氯胺酮联合10 μg/g赛拉嗪（具体请咨询动物护理机构以获取批准和订购信息）。
注意：Avertin 溶液应每两周配制一次，使用 0.22 μm 滤器过滤除菌，并分装为 500 μl 等份，于 4 °C 避光保存。 - 使用小型动物剃毛器剃除肿瘤区域上方的毛发。
- 使用Nair脱毛膏（可在任意药店购买）去除剩余毛发。用浸有乙醇的棉签清洁皮肤。
- 将动物转移至无菌纱布上，并在眼睛处涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥和感染。
- 用碘伏对皮肤进行消毒，再用70%乙醇清洁。
- 将动物转移至无菌操作台内的无菌手术布上。
- 用镊子夹住乳头内侧紧邻的皮肤，切开约2 mm的切口。
- 使用解剖剪刀和镊子将乳腺下方的脂肪垫与皮肤分离。在分离过程中，皮肤和孔洞会拉伸至足以容纳显微注射装置（MIW）插入的大小。
- 若手术中不慎损伤血管，应使用无菌棉签清除产生的血液，以防止出血过多。
- 将MIW插入，使其基底部上方覆盖皮肤，并使用不可吸收缝线和反向切割针缝合固定。
- 使用组织粘合剂或氰基丙烯酸酯填充缝合孔，并将MIW固定在皮肤上。
- 手术前后3天，在笼内水瓶中加入TMP-SMX抗生素混合液（磺胺甲噁唑0.6 mg/ml，甲氧苄啶0.12 mg/ml）。
- 动物在腹腔注射 Avertin 后会保持麻醉状态 1–4 小时。由于手术通常持续约 45 分钟，术后帮助动物恢复至关重要：
- 在笼子底部放置一个加热垫（37 °C）（可在药店购买），并用纱布覆盖。
- 将动物保持在垫子上方，直到其翻转至腹部朝下并开始行走。
- 如果动物失去意识超过3小时，需腹腔注射0.3 ml HBSS以补充水分。
- 动物在首次成像前需恢复3-4天。
4. 成像箱构建
成像箱可确保显微操作窗（MIW）平整地位于显微镜物镜正上方。同时，通过持续输送异氟烷气流，该装置还能实现温度和麻醉的控制。成像箱由有机玻璃制成，并使用塑料焊胶粘合而成。其设计适配特定的显微镜载物台，因此底部形状因所用显微镜型号而异（图2展示了适配Leica SP5显微镜载物台的成像箱示意图）。
成像箱的尺寸（厘米）为长11.4 cm、宽7.6 cm、高4.4 cm（图2A）。箱体底部由一块12.7 cm × 8.4 cm的中空板构成，该板可嵌入Leica SP5显微镜载物台内；另有两块可滑动的“门板”，每块尺寸为5.7 cm × 5.7 cm，闭合时形成一个直径为2.22 cm的圆形开口，显微操作窗（MIW）即嵌入此开口中。前面板设有麻醉气体输入孔，侧板之一则设有通向真空系统的排气孔。
请注意，在放置成像箱前，需先移除聚光镜和载玻片夹持器。
5. 成像箱使用
- 使用异氟烷对动物实施麻醉，并在眼睛上涂抹眼用软膏。
- 将麻醉机的异氟烷废气管连接至成像箱前端，位于进气孔外侧（图 2B）。
- 将第二根管子连接至成像箱的出气孔。该管子应连接至气体过滤器，再接入真空系统。
- 打开箱盖和箱门，将动物放入箱内，使MIW侧朝向底部，并滑动箱门将其关闭。
- 固定成像箱并调节底部滑动门，使MIW底座被夹紧并固定在两门之间。MIW底座应与成像箱门处于同一水平面，而MIW的盖玻片应略低于此水平面几毫米。确保MIW在底部滑动门之间的位置使盖玻片（MIW的玻璃部分）保持平整，与箱体底部门平行，以保证正确的聚焦。
- 降低显微镜物镜，为将成像箱放置在显微镜载物台上预留空间。
- 将成像箱放置在显微镜载物台上，并调节载物台位置，使MIW的盖玻片位于物镜上方。
- 调节焦点并开始成像。
- 使用异氟烷期间，应通过观察呼吸频率对动物进行监测。可通过肉眼观察，或通过监测成像过程中出现的呼吸伪影频率来实现（这些伪影可能干扰数据采集）。MouseOx脉搏血氧监测系统（Starr Life Sciences Corp）已被成功应用，从而可在不开启室内灯光检查动物的情况下连续采集数据。
注意：每次成像结束后，应在笼内将小型加热垫用纱布或Kimwipes纸包裹后置于动物身下，以促进动物恢复。
注意：若使用浸没物镜透过MIW进行成像，应将浸没介质（甘油、水或油）从成像窗口清除。应检查MIW是否存在裂纹或其他成像过程中可能造成的损伤。这对于多次成像实验中的数据采集至关重要。
6. Dendra2标记细胞的光转换与成像
本实验方案以徕卡SP5共聚焦显微镜为例进行描述；当使用其他共聚焦显微镜或多光子成像系统时，焦平面上的激光功率、可用物镜及软件选项会有所不同，因此以下所述方案应作为在您所使用的显微镜上优化实验的参考指南。
- 通过目镜（10倍）使用绿色荧光滤光片观察肿瘤，定位明显有血流且处于同一焦平面的主血管。
- 将其中一条血管置于视野中央，切换至PMT检测模式。
- 设置双通道顺序成像采集。其中一个通道使用488 nm激光线（10%功率），采集细胞外基质的散射光（480–495 nm）以及Dendra2绿色形式的发射光（505–540 nm）；第二个通道使用543 nm激光线（90%功率），采集Dendra2红色形式的发射光（555–600 nm）。采集光转换前的三维图像。
- 使用ROI扫描功能，选择特定细胞群体，利用405 nm激光线（30%功率，20–40次扫描）进行光转换。采集蛋白红色形式的发射光以监测转换过程。
- 采用与步骤6.3相同的顺序成像程序，采集光转换后的三维图像。
- 若在肿瘤中对多个区域进行光转换，建议使用数码相机通过目镜在绿色和红色通道下分别拍照（图3A、B），以便在后续成像过程中进行定位。
注意：此外，可通过尾静脉注射荧光葡聚糖（Cascade Blue或Alexa Fluor 647，均为10 kDa）对血管进行临时标记。注射数小时后，葡聚糖将离开血管并永久标记巨噬细胞。
代表性结果：
图3C显示了一个矩形的光转换区域（红色），其方向与血管垂直（无荧光）。未进行光转换的细胞呈绿色，而细胞外基质的散射呈紫色。该图像为沿Z轴（20-50 μm深度）的四幅图像的最大强度投影。
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致谢
本研究由美国国防部（B.G. 项目编号 BC075554，D.K. 项目编号 BC061403）和美国国立卫生研究院（J.v.R. 项目编号 U54GM064346；J.C.、J.E.S. 和 J.W. 项目编号 CA100324；J.E.S. 项目编号 CA77522；J.C. 和 B.G. 项目编号 U54CA126511）资助。感谢 D. Entenberg 在显微成像方面的协助，M. Rottenkolber 在成像箱制作中的帮助，以及 J. Pollard（阿尔伯特·爱因斯坦医学院）提供 F4/80 抗体。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含 Ca、Mg 的 PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| 胰蛋白酶 | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM 培养基（MDA-MB-231 细胞） | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| 异氟烷（Aerrane） | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID 小鼠 | 国家癌症研究所 | N/A | |
| 培养皿 | BD Biosciences | 353003 | 定制订单 |
| 8 mm 圆形盖玻片 | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
参考文献
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