通过乳腺成像窗口实现Dendra2光转换

摘要

通过乳腺成像窗口对Dendra2标记的肿瘤细胞进行活体光转换和追踪，是一种能够在数天时间尺度上对特定肿瘤微环境中的肿瘤细胞转移行为进行成像的技术。

摘要

在过去的十年中，对小鼠和大鼠乳腺肿瘤的单细胞分辨率活体显微成像^1-4已为肿瘤细胞的转移行为机制（如迁移、侵袭和内渗）提供了重要的研究见解^{5, 6}, 血管生成³以及免疫细胞的反应^7-9. 我们最近报道了一种在活体小鼠中对原位乳腺癌进行多次活体成像的技术¹⁰为此，我们开发了一种乳腺成像窗（Mammary Imaging Window, MIW），并优化了Dendra2的成像参数¹¹光开关与成像in vivo. 此处，我们描述了制造显微成像窗（MIW）、将MIW植入肿瘤表面以及使用定制成像盒对Dendra2标记的肿瘤细胞进行成像的实验方案。该方案可用于在不同肿瘤微环境中观察肿瘤细胞的转移行为，并实现对血管、肿瘤细胞及宿主细胞的长期成像。

方案

1. 通过将肿瘤细胞注射到乳腺脂肪垫中生成荧光肿瘤：

1. 将表达 Dendra2 蛋白（作为细胞质标记物）的细胞系培养至 40 - 80% 汇合度。
2. 用不含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS 至少冲洗培养皿 3 次。
3. 每 10 cm 培养皿中加入 3 ml 胰蛋白酶，37 °C 孵育直至大多数细胞脱落，然后将培养皿撞击平坦表面以振落细胞。
4. 将所有细胞从培养皿上冲洗下来，同时使用刮刀（橡胶刮铲）收集基质成分。  加入 5 ml PBS。 在离心过程中取部分样品进行细胞计数。
5. 以 800 g 离心 5 分钟。
6. 吸除上清，用 PBS 重悬细胞至浓度为 5–10×10⁶/ml。  冰上保存，并在 30 分钟内完成注射。
7. 将装有 4–5 周龄雌性免疫缺陷小鼠（例如 SCID 小鼠）的笼子放入无菌操作台内。
8. 用 70% 乙醇喷洒第 4 对（腹部）乳头周围区域。
9. 向乳腺脂肪垫内注射 0.1 ml 细胞悬液。若有助手协助，一人可固定小鼠，另一人将针头插入乳腺脂肪垫。若独自操作，可使用异氟烷对小鼠实施轻度麻醉后再进行注射。
10. 当肿瘤生长至 5–7 mm 时，应植入乳腺成像窗（MIW）。
    注意：对于某些实验应用，也可先在健康的乳腺脂肪垫上植入 MIW，之后再注射....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含 Ca、Mg 的 PBS	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
胰蛋白酶	GIBCO, by Life Technologies	25300
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14025
DMEM 培养基（MDA-MB-231 细胞）	GIBCO, by Life Technologies	11965
异氟烷（Aerrane）	Baxter Internationl Inc.	# NDC 10019-773-40
SCID 小鼠	国家癌症研究所	N/A
培养皿	BD Biosciences	353003	定制订单
8 mm 圆形盖玻片	Scientific, Inc.	8CIR-1-FIS