刮痧疗法中血红素加氧酶-1 上调的生物发光成像

摘要

刮痧是一种传统的中医治疗性皮肤刮擦疗法，可引起皮下微血管的血液外渗。本文报道了一种利用血红素加氧酶-1（HO-1）-luciferase 转基因小鼠进行生物发光成像的实验方案，以证明刮痧可在多个器官中上调血红素加氧酶-1（HO-1）的表达。

摘要

刮痧是一种传统的中医疗法，通过皮肤刮擦导致皮下微血管出血和瘀斑。血红素加氧酶-1（HO-1）生物发光光学成像的实验方案luciferase 本手稿中报道的转基因小鼠提供了一种快速in vivo检测刮痧操作后血红素加氧酶-1（HO-1）基因表达的上调。HO-1 长期以来被认为可提供针对氧化应激的细胞保护作用。通过生物发光信号评估的 HO-1 上调被认为代表了机体对刮痧释放入循环的血红蛋白产物所产生的一种抗氧化反应。刮痧操作采用光滑的汤匙边缘，在转基因小鼠背部或其他目标部位的润滑皮肤上反复刮拭，直至观察到提示皮下毛细血管出血的皮肤表现，如瘀点（裂片状出血）或瘀斑（挫伤）。刮痧后，连续数日每日进行生物发光成像，以追踪多个内脏器官中 HO-1 表达的动态变化。

方案

1. 雌性 HO-1-luciferase 可从 Taconic Farms, Inc. 购买 4–6 周龄的转基因小鼠。到达后, 小鼠被安置在动物饲养设施中至少4天以适应环境。
2. 生物发光成像的准备工作：
   1. 称量每只HO-1小鼠。动物体重用于计算荧光素的给药剂量。
   2. 脱毛： 使用棉签将脱毛剂Nair®涂抹于动物的腹部和/或背部，等待5至10秒。用干净的棉签擦去毛发。取一片组织纸浸入蒸馏水中，擦拭残留的毛发直至清洁。
   3. 在IVIS 100成像系统的成像平台上放置一张非荧光黑色纸（Strathmore Artagain® 黑色纸），以降低背景噪声。
   4. 准备荧光素（来自 Xenogen Corporation）溶液，浓度为 7.5 mg/ml（溶于无菌 H₂O）。荧光素的剂量为每公斤体重65.5 mg。因此，一只20克重的小鼠需腹腔注射0.175 ml荧光素溶液。为实现该操作，将单次注射量的荧光素溶液（0.175 ml）预先装入带有26号针头的注射器中
3. 刮痧操作步骤： 刮痧仅在进行生物发光成像实验前实施一次。由于刮痧不会引起疼痛，小鼠仅需通过异氟烷短暂麻醉以保持安静。刮痧操作包括以下步骤：
   1. 在刮痧过程中，数次于刮痧部位涂抹食用油或蒸馏水以润滑皮肤。
   2. 使用陶瓷汤匙或塑料汤匙，以轻柔但有力的方式反复刮擦小鼠背部无毛区域。
   3. 刮拭持续至背部皮肤发红，这是皮下出血的征象，通常在2到3分钟内达到。
4. 生物发光成像 可在刮痧后立即开始，或在刮痧后数小时开始，因为HO-1的上调在数小时内逐渐增强。生物发光成像的操作步骤如下：
   1. 在充满异氟烷（1.5%）与医用级空气混合气体的麻醉诱导舱中对小鼠进行麻醉。
   2. 小鼠麻醉后，将其转移至IVIS 100光学成像系统的成像室中，置于仰卧位（腹部朝上）。成像室持续通入1.5%异氟烷，成像平台加热至 37°C 保持小鼠体温。
   3. 将成像采集设置为“中等 binning”模式，曝光时间设为 30 秒。开始采集图像，并设置仪器每三分钟重复一次成像采集，可手动或自动进行。在首张图像采集完成后，绘制一个感兴趣区域（ROI），覆盖腹部、胸部和头部区域。随后使用 IVIS 100 系统配套的“Living Image®”软件，将该 ROI 复制并粘贴至后续各图像中。
   4. 信号强度以每秒光子数进行测量。标记信号强度达到峰值的时间，并在达到峰值后继续对小鼠成像约5至10分钟。
   5. 当完成仰卧位的成像采集后，将小鼠翻转，使其呈俯卧位（背部朝上）。继续使用“Living Image®”软件对动物进行5至10分钟的成像，此时感兴趣区域（ROI）应绘制为覆盖背部和头部区域。俯卧位成像在仰卧位之后进行的选择是任意的；可根据主要关注的器官决定是否以俯卧位作为起始成像体位。另一种可选方案是在不同的实验中分别进行仰卧位和俯卧位的成像。
   6. 当俯卧位成像采集结束后，关闭异氟烷，将小鼠从成像室转移至诱导室以恢复。此时诱导室仅通入医用空气，小鼠通常在不到一分钟内苏醒。
   7. 保存成像数据以供后期处理。
   8. 初次成像研究后，将在刮痧后的数天内进行额外的影像采集。一个示例时间表是在第12天重复成像^th 小时，24^th 小时，36^th 小时，48^th 小时，72^nd 小时和120^th 1 小时，但成像时间表的具体时间安排可灵活调整。如果需要更长时间的随访，可增加额外的成像环节。成像前，若毛发已重新生长，需重复脱毛操作。
5. 对照组重复所有步骤，但跳过刮痧（步骤3）。若同一组小鼠同时用于对照和刮痧实验，对照实验应优先在刮痧操作前进行，或至少在刮痧后一个月进行。

代表性结果：

图1中的生物发光图像显示 体内 刮痧刺激后HO-1的上调。图2中的图表显示了同一小鼠在刮痧后120小时内全身光学通量（光子/秒）随时间变化的定量结果。

图1. 从左到右分别为同一小鼠在刮痧前、刮痧后18小时、36小时和120小时的前位（仰卧）代表性图像。刮痧后，可观察到多个器官区域信号强度显著增强，包括胃肠道、生殖道、肝脏、肾脏（背面视图，未显示）及其他部位。请点击此处查看图1的放大版本。

图 2. 对图 1 中同一只小鼠进行刮痧后120小时内全身光子通量（光子/秒）的定量变化。请点击此处查看图 2 的放大版本。

讨论

血红素加氧酶的可诱导形式 HO-1 的转录可被多种因素上调，包括血红素、过氧化氢、紫外线照射、缺氧和物理应激。全身成像技术（如已报道的 HO-1 生物发光检测方案）可快速呈现多个器官中系统性 HO-1 表达的概况。在小型动物中，生物发光成像能够对系统性基因表达的变化进行高灵敏度、活体、实时、定量且纵向的光学评估，如图所示。生物发光分子成像降低了小型动物基因表达检测的成本，并提高了通量，使其能够快速获得足够的统计效力，用于复杂系统生物学假说的研究，以及评估拟议的药物和其他治疗干预措施的全身效应。其局限性之一是解剖结构的空间分辨率较低。具备断层成像能力的新型光学成像系统可缓解这一问题。通过显微计算机断层扫描（micro-CT）或小型动物磁共振成像（MRI）进行图像采集与配准，将有助于准确定位解剖结构。其他局限性包括光在组织中的穿透深度有限，以及需要使用转基因动物。这些因素基本排除了该技术向大型动物或人类应用的转化，但对于小型动物的系统生物学研究或临床前治疗假说验证而言，并非显著缺陷。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光素	Caliper Life Sciences	P/N 122796	曾用名 Xenogen
IVIS 100	Caliper Life Sciences		曾用名 Xenogen