本视频文章逐步介绍了如何处理精液样本,以在人类精子上获得高质量的荧光原位杂交结果。所获得的样本可用于临床诊断背景下的非整倍体筛查。
本视频文章逐步介绍了如何处理精液样本,以在人类精子上获得高质量的荧光原位杂交结果。所获得的样本可用于临床诊断背景下的非整倍体筛查。
非整倍体是人类中最常见的染色体异常。这些异常大多源于父母生殖过程中减数分裂时发生的错误。在人类男性中,这些错误可导致产生具有染色体数目异常的精子,从而增加将此类异常遗传给后代的风险。
因此,精子细胞核荧光原位杂交(FISH)技术已成为临床诊断中广泛采用的一种实验方案。该方法可评估寻求遗传性生殖咨询的患者其配子中染色体数目异常的频率。
迄今为止,精子FISH分析中最常检测的染色体包括X、Y、13、18和21号染色体。
本视频文章逐步介绍了如何处理和固定人类精液样本,如何使精子染色质去凝集和变性,如何制备精子FISH样本,以及如何在显微镜下观察结果。文中对最关键的步骤给出了特别说明,以帮助获得最佳实验结果。
一、样品处理与细胞固定
II. 去浓缩
三、杂交
IV. 杂交后洗涤
V. 可视化
可使用配备DAPI/Texas Red/FITC三通道滤光片以及Aqua、FITC和Texas Red单通道滤光片的落射荧光显微镜对制备样品进行观察。精子细胞核的正确评估必须遵循标准评估标准1。
与X、Y和18号染色体探针杂交的标本应显示这三条染色体的信号。每个正常的精子必须显示一个蓝色信号(对应18号染色体),以及一个绿色信号(含X染色体的精子)或一个红色信号(含Y染色体的精子)。
在使用13号和21号染色体探针进行杂交的制备过程中,每个正常的精子应能区分出13号染色体的绿色信号和21号染色体的红色信号。
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本方案描述了如何处理人类精液样本以获得精子FISH制片。通过本方案,可分析男性配子中的染色体异常。精子非整倍体筛查既可用于基础研究,也可用于为不育男性提供生殖咨询。尽管在临床诊断中主要研究的染色体为X、Y、13、18和21号染色体,但市场上也有针对多种其他染色体和位点的商用探针,均可用于此类实验。
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作由加泰罗尼亚自治区政府(2005-SGR00437)资助。作者感谢 J. Blanco 和 F. Vidal 的指导与鼓励,以及 J. Lucas 提供的技术支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 1,4-二硫苏糖醇(DTT) | 材料 | 罗氏集团 | 10197777001 | |
| 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇 | 材料 | 罗氏集团 | 10708976001 | |
| 乙酸 | 材料 | 默克 & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® 多色DNA探针试剂盒
| 材料 | Vysis 公司 | 32-161075
| |
| Centrifuge 5804R | 工具 | Eppendorf | ||
| 离心管 | 材料 | Nalge Nunc International | 347856 | |
| 玻璃 Coplin 瓶 | 材料 | 巴洛世界科学公司 | 赫伦达尔(ZCT278) | |
| 塑料 Coplin 瓶 | 材料 | Deltalab | 191087 | |
| 盖玻片(15×15) | 材料 | Knittel Glaser | 4600115 | |
| 盖玻片(18×18) | 材料 | 克尼特尔-格拉泽 | 4600118 | |
| 金刚石笔 | 材料 | Hammacher | 335117010 | |
| 乙醇 | 材料 | 默克 & Co., Inc. | 100.983 | |
| 甲酰胺 | 材料 | 罗氏集团 | 11814320001 | |
| 冷冻机 | 工具 | Zanussi | ||
| 手套 | 材料 | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | 工具 | Vysis 公司 | ||
| 浸油 | 材料 | 奥林巴斯株式会社 | 35505 | |
| 培养箱 | 工具 | Heraeus Instruments | ||
| 甲醇 | 材料 | 默克 & Co., Inc. | 106.009 | |
| 微量移液器 | 材料 | 实验室系统 | Finnpipette(4500000) | |
| 微量移液器更换吸头 | 材料 | 达斯实验室 | 16-2001 | |
| 指甲油 | 材料 | Quo-cosmetics | ||
| 奥林巴斯BX60落射荧光显微镜 | 工具 | 奥林巴斯株式会社 | 配备DAPI/Texas Red/FITC三通道滤光片,以及Aqua、FITC和Texas Red单通道滤光片。 | |
| 巴斯德吸管 | 材料 | 鲁比劳 | 211.0230 | |
| 相差显微镜 | 工具 | 尼康仪器公司 | ||
| 塑料移液管(3 ml) | 材料 | Deltalab | 200007 | |
| 氯化钾(KCl) | 材料 | Fluka | 60128 | |
| 橡胶水泥 | 材料 | 最佳测试 | ||
| 载玻片 | 材料 | Knittel Glaser | 4520022 | |
| 载玻片保存盒 | 材料 | Deltalab | 19276.1 | |
| 无菌容器 | 材料 | Deltalab | 409726 | |
| 注射器 | 材料 | PentaFerte | 002022300 | |
| 温度计 | 材料 | 康马克仪器公司 | KM12 | |
| 三蒸水 | 材料 | |||
| Triton X-100 | 材料 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 镊子 | 材料 | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| 垂直层流 超净工作台 | 工具 | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| 涡旋混合器 | 工具 | Fisher Scientific | FB15012 | |
| 水浴锅 | 工具 | Raypa® |
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