荧光 原位 人类精子中的荧光原位杂交（FISH）实验方案

摘要

本视频文章逐步介绍了如何处理精液样本，以在人类精子上获得高质量的荧光原位杂交结果。所获得的样本可用于临床诊断背景下的非整倍体筛查。

摘要

非整倍体是人类中最常见的染色体异常。这些异常大多源于父母生殖过程中减数分裂时发生的错误。在人类男性中，这些错误可导致产生具有染色体数目异常的精子，从而增加将此类异常遗传给后代的风险。

因此，精子细胞核荧光原位杂交（FISH）技术已成为临床诊断中广泛采用的一种实验方案。该方法可评估寻求遗传性生殖咨询的患者其配子中染色体数目异常的频率。

迄今为止，精子FISH分析中最常检测的染色体包括X、Y、13、18和21号染色体。

本视频文章逐步介绍了如何处理和固定人类精液样本，如何使精子染色质去凝集和变性，如何制备精子FISH样本，以及如何在显微镜下观察结果。文中对最关键的步骤给出了特别说明，以帮助获得最佳实验结果。

方案

一、样品处理与细胞固定

1. 将精液样本置于室温下的无菌容器中静置 20 分钟，直至液化。
2. 将样本转移至离心管中，在 1000g 条件下离心 5 分钟。
3. 使用巴斯德吸管轻轻移除并弃去上清液。
4. 逐滴加入预热至 37°C 的低渗溶液（0.075M KCl），同时在涡旋振荡器上混匀，最终体积为 10 ml。
5. 将离心管置于 37°C 水浴中孵育 30 分钟。
6. 在 1000g 条件下离心 5 分钟。小心倾倒弃去上清液，避免扰动沉淀物。
7. 将沉淀重悬后，逐滴加入新鲜配制的卡诺固定液（甲醇:乙酸 = 3:1），同时在涡旋振荡器上混匀，最终体积为 8 ml。
8. 根据需要重复步骤 6 和 7，直至获得白色沉淀。
9. 逐滴加入新鲜配制的甲醇:乙酸（3:1）溶液，调整最终体积至获得良好细胞铺展所需的细胞浓度（对于沉淀较少的样本，仅需少量滴加；而对于回收精子较多的样本，最终体积可达 1–2 ml）。可通过将重悬的样本滴加至未磨砂载玻片上，在相差显微镜下观察制备测试片。这有助于检查所获得的细胞分散情况，并可在后续制片中进行调整。
10. 制片时，从至少 40 cm 的高度将两到三滴细胞悬液滴加至未磨砂载玻片中央（载玻片此前应保存于 -20°C 的甲醇中以去除油脂）。为便于在整个实验流程中定位样本，使用金刚石笔在载玻片的另一侧标记出精子涂片区域。
11. 将载玻片在 -20°C 下保存至少 24 小时。
    注意：在混匀过程中逐滴加入甲醇:乙酸（3:1）是防止精子聚集形成团块的关键步骤。

II. 去浓缩

1. 存放于 -20°C 的载玻片必须解冻后方可继续操作（将其置于室温下）。
2. 将载玻片依次放入两个盛有 2 倍浓度的氯化钠-柠檬酸钠溶液（2xSSC）的考普林瓶中，每个考普林瓶中孵育 3 分钟。
3. 将载玻片依次在系列乙醇溶液中洗涤，每个考普林瓶中处理 2 分钟。依次使用 70% 乙醇、90% 乙醇，最后用 100% 乙醇。随后将载玻片置于室温下干燥。
4. 将载玻片放入二硫苏糖醇溶液（1,4-二硫苏糖醇 5 mM、1% Triton X-100、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇 50 mM）中，在 37°C 孵育箱中孵育，以解聚染色质。该试剂通过断裂精子细胞核中鱼精蛋白的二硫键，使 DNA 解链。此步骤极为关键，因为精子细胞核中的 DNA 高度压缩。载玻片在二硫苏糖醇溶液（DTT）中的孵育时间需根据样本对此试剂的反应性进行调整。通常孵育时间约为 8 分钟，但可根据情况在 2 至 15 分钟之间调整。
5. 立即把载玻片转移至两个盛有 2xSSC 溶液的连续考普林瓶中，每个考普林瓶中孵育 3 分钟。
6. 继续将载玻片依次放入盛有系列乙醇溶液的考普林瓶中洗涤，每个考普林瓶中处理 2 分钟（70%、90% 和 100% 乙醇）。将载玻片置于室温下自然干燥。
   注意：DTT 处理时间过长会导致荧光原位杂交（FISH）信号弥散，而处理时间过短则可能导致部分信号缺失。

三、杂交

1. 将载玻片放入盛有甲酰胺溶液（70% 甲酰胺/2xSSC）的考普林瓶中，在73°C下孵育5分钟，以使精子DNA变性。
2. 将载玻片依次转移至各考普林瓶中的乙醇溶液中，每个浓度乙醇溶液中浸泡1分钟（依次为70%、85%，最后为100%）。随后将载玻片置于室温下自然干燥。
3. 取5 µL相应的即用型探针混合液，直接加至15x15盖玻片上（AneuVysion检测多色探针组：CEP 18/X/Y 或 LSI 13/21）。
4. 如视频所示，小心地将载玻片覆盖在盖玻片上，使目标区域与探针混合液充分接触，然后用橡胶胶水密封。
5. 将载玻片放入预热至37°C的杂交仪（HYBrite™）中，在37°C下孵育6–24小时。
   注：精子样本的变性步骤是必需的，而探针是否需要变性则由制造商决定。本实验所用探针混合液为即用型，无需进行探针变性处理。
   探针混合液的用量需根据杂交区域的大小进行调整。

IV. 杂交后洗涤

1. 从杂交室中取出载玻片。
2. 去除橡胶胶水，轻轻侧向滑动并小心取出盖玻片。
3. 为消除非特异性杂交信号，将载玻片置于盛有预热至73°C的0.4xSSC/0.3%NP-40溶液的柯氏瓶（coplin jar）中，孵育2分钟。
4. 将载玻片转移至室温下的2xSSC/0.1%NP-40洗涤液中，洗涤1分钟。随后让载玻片在室温下自然干燥。
5. 在目标区域加入复染试剂（对于18×18的盖玻片，用量为8 µL）。最常用的试剂为4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Vysis Inc.）。
6. 如视频所示，用盖玻片覆盖杂交区域（为保护杂交结果，可用指甲油封固盖玻片）。
7. 将完成杂交的载玻片置于-20°C避光保存，直至后续分析。在此条件下，载玻片可保存长达12个月，而荧光信号强度无明显衰减。
   注意：过高的温度或过长的洗涤时间可能导致部分信号丢失，而相反条件则可能无法有效去除非特异性探针杂交信号。
   所加复染试剂的体积需根据杂交区域的大小进行调整。

V. 可视化

可使用配备DAPI/Texas Red/FITC三通道滤光片以及Aqua、FITC和Texas Red单通道滤光片的落射荧光显微镜对制备样品进行观察。精子细胞核的正确评估必须遵循标准评估标准¹。

与X、Y和18号染色体探针杂交的标本应显示这三条染色体的信号。每个正常的精子必须显示一个蓝色信号（对应18号染色体），以及一个绿色信号（含X染色体的精子）或一个红色信号（含Y染色体的精子）。

在使用13号和21号染色体探针进行杂交的制备过程中，每个正常的精子应能区分出13号染色体的绿色信号和21号染色体的红色信号。

讨论

本方案描述了如何处理人类精液样本以获得精子FISH制片。通过本方案，可分析男性配子中的染色体异常。精子非整倍体筛查既可用于基础研究，也可用于为不育男性提供生殖咨询。尽管在临床诊断中主要研究的染色体为X、Y、13、18和21号染色体，但市场上也有针对多种其他染色体和位点的商用探针，均可用于此类实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,4-二硫苏糖醇（DTT）	材料	罗氏集团	10197777001
2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇	材料	罗氏集团	10708976001
乙酸	材料	默克 & Co., Inc.	100.063
AneuVysion® 多色DNA探针试剂盒 <李>20x 盐水-柠檬酸钠<李>4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI II）<李>CEP 18/X/Y DNA探针<李>NP-40<李>LSI 13/21 DNA探针	材料	Vysis 公司	32-161075 <李>30-805850<李>30-804941 <李>30-171077<李>30-804820<李>30-171078
Centrifuge 5804R	工具	Eppendorf
离心管	材料	Nalge Nunc International	347856
玻璃 Coplin 瓶	材料	巴洛世界科学公司	赫伦达尔（ZCT278）
塑料 Coplin 瓶	材料	Deltalab	191087
盖玻片（15×15）	材料	Knittel Glaser	4600115
盖玻片（18×18）	材料	克尼特尔-格拉泽	4600118
金刚石笔	材料	Hammacher	335117010
乙醇	材料	默克 & Co., Inc.	100.983
甲酰胺	材料	罗氏集团	11814320001
冷冻机	工具	Zanussi
手套	材料	Sanyo	101/3300
HYBrite™	工具	Vysis 公司
浸油	材料	奥林巴斯株式会社	35505
培养箱	工具	Heraeus Instruments
甲醇	材料	默克 & Co., Inc.	106.009
微量移液器	材料	实验室系统	Finnpipette（4500000）
微量移液器更换吸头	材料	达斯实验室	16-2001
指甲油	材料	Quo-cosmetics
奥林巴斯BX60落射荧光显微镜	工具	奥林巴斯株式会社		配备DAPI/Texas Red/FITC三通道滤光片，以及Aqua、FITC和Texas Red单通道滤光片。
巴斯德吸管	材料	鲁比劳	211.0230
相差显微镜	工具	尼康仪器公司
塑料移液管（3 ml）	材料	Deltalab	200007
氯化钾（KCl）	材料	Fluka	60128
橡胶水泥	材料	最佳测试
载玻片	材料	Knittel Glaser	4520022
载玻片保存盒	材料	Deltalab	19276.1
无菌容器	材料	Deltalab	409726
注射器	材料	PentaFerte	002022300
温度计	材料	康马克仪器公司	KM12
三蒸水	材料
Triton X-100	材料	Sigma-Aldrich	9002-93-1
镊子	材料	B. Braun Medical	Aesculap (BD224R)
垂直层流 超净工作台	工具	Burdinola	OR-ST 1500
涡旋混合器	工具	Fisher Scientific	FB15012
水浴锅	工具	Raypa®