本文介绍了一种对幼虫和成虫黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）心脏管不同组分进行荧光标记的基本实验方案。这些样本适用于荧光显微镜或共聚焦显微镜成像。该技术可对这一强大模式生物的心脏结构特征进行详细的形态学分析。
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本文内容
摘要
摘要
TheDrosophila melanogaster背血管，即心脏，是一种管状结构，由单层收缩性心肌细胞、沿心壁两侧排列的围心细胞、支持性的翼状肌以及在成虫中还有一层腹侧纵行肌细胞组成。收缩纤维中含有肌肉细胞骨架的保守组分，包括紧密排列的肌原纤维束以及细胞骨架/膜下蛋白复合物，这些组分与细胞外基质中的同源成分相互作用。本文中，我们描述了一种对解剖所得幼虫及半完整成虫心脏中的特定心肌组分进行固定和荧光标记的实验方案。Drosophila. 具体而言，我们展示了在幼虫心脏中标记肌节中的F-肌动蛋白和α-辅肌动蛋白的方法。此外，我们在表达肌球蛋白-GFP的成年果蝇中对F-肌动蛋白和α-辅肌动蛋白进行标记，并在野生型成年果蝇心脏中对α-辅肌动蛋白以及IV型细胞外基质胶原蛋白——层粘连蛋白（pericardin）进行标记。本实验特别关注一种用于半完整成年心脏的封片策略，该策略可最大限度减少操作步骤，优化维持心脏管及其相关组织完整性的机会。这些样品适用于荧光显微镜和共聚焦显微镜成像。总体而言，该方法使得研究者能够对这一遗传操作性强的模式生物系统中心脏的结构特征进行细致而深入的分析。
方案
开始之前
- 配制以下溶液：
- 松弛缓冲液（含 10 mM EGTA 的人工 Drosophila 血淋巴（ADH）（参见“在 Drosophila 中观察跳动的心脏”）
- 固定液（含 4% 甲醛的 1× PBS）
- PBSTx（含 0.1% Triton-X-100 的 PBS）
- 用 PBSTx 适当稀释的一抗及种属特异的荧光标记二抗
- 解剖 Drosophila 以暴露心脏管（成虫和/或幼虫），操作步骤如下：
- 参照“在 Drosophila 中观察跳动的心脏”中的半完整 Drosophila 心脏制备方案，或
- Drosophila 幼虫神经肌肉接头解剖方案1，并作如下修改：幼虫解剖过程中使用充氧的 ADH，并将后端固定针略微偏离腹侧中线。沿腹侧中线剪开幼虫。固定前不要移除任何组织。
荧光染色
- 检查所有心脏在充氧的ADH中是否节律性跳动。迅速用松弛缓冲液替换ADH。逐一检查每个心管，确保收缩已被抑制。
- 用固定剂替换松弛缓冲液以固定心脏。室温下轻轻振荡孵育20分钟。（对于幼虫样本，任何步骤均无需振荡，且振荡可能对心脏组织完整性造成不利影响）。
- 用PBSTx在室温下持续振荡清洗样本三次，每次十分钟。
- 对于成虫，小心修剪腹部角质层的腹侧边缘，使其保留部分更趋椭圆形而非圆形。此外，通过在腹部与胸部之间进行一次切割，仔细且干净地分离这两个体段，并确保对心脏前部区域的损伤最小。对于幼虫心脏，使用精细镊子小心去除脂肪体。脂肪体的去除必须极为谨慎，因为幼虫心脏特别脆弱，缺乏其他肌肉或结缔组织的支持。请勿移除气管分支，以免损伤心脏。
- 通过边缘转移已修剪的腹部角质层背侧部分，避免接触位于中央的心管，将其放入96孔板中，每孔含有50–100 μl用PBSTx稀释的一抗溶液。每孔放置不超过12个样本。室温下持续振荡孵育2小时，也可在4°C下过夜孵育。
- 移除一抗溶液。用100 μl PBSTx在室温下持续振荡清洗心脏三次，每次十分钟。
- 在最后一次清洗缓冲液移除后，加入100 μl用PBSTx稀释的二抗溶液，并添加Alexa594-鬼笔环肽（1:1000）。室温下持续振荡孵育一小时。样品需避光保存，防止荧光基团漂白。
- 二抗孵育结束后，用100 μl PBSTx在室温下持续振荡清洗心脏三次，每次十分钟。整个清洗过程中均需将样品避光保存。
- 为去除Triton-X-100，最后用100 μl PBS清洗心脏一次，持续10分钟。样品可在4°C黑暗环境中保存数天后再进行封片。
成年心脏的制备
- 用 10 μl 封片剂（Vectashield）将两片 18 × 18 mm 的盖玻片粘附在显微镜载玻片上，两片盖玻片之间应相距约 10–15 mm。在两片盖玻片之间再放置一小滴封片剂。
- 在第三片盖玻片中央加入 20 μl Vectashield 封片剂。
- 用镊子夹住每颗心脏样本的角质层边缘，小心地从 PBS 洗涤液中取出，并轻轻将心脏面朝下放置在第三片盖玻片上的封片剂液滴中。每滴封片剂上放置的心脏数量不超过五个。
- 在显微镜下检查，确保所有心脏均朝下放置。
- 小心地将带有心脏的盖玻片翻转，迅速放置在载玻片上那对盖玻片之上，使含有心脏组织的液滴与两片盖玻片之间的 Vectashield 液滴融合，形成“桥接”结构。此时心脏将悬浮于盖玻片与显微镜载玻片之间。
- 在显微镜下检查，确认心脏现在朝上。
- 用指甲油将盖玻片边缘固定密封。
- 样本现已准备好，可通过荧光显微镜或共聚焦显微镜进行成像。
幼虫心脏的制备
- 在显微镜载玻片上滴加一滴（约 20 μl）Vectashield。
- 小心地将最多两个幼虫样本转移至 Vectashield 中，并使用钨针将其背侧朝下摆放。
- 逐个将样本从封片介质中拖出，并将其平行排列。
- 在样本两端相对的位置放置盖玻片。用镊子将第三片盖玻片置于其上，先将一侧搭在后端的盖玻片上，然后缓缓放下至前端的盖玻片，形成一座“桥”。毛细作用会使 Vectashield 从后端向前端流动，有助于幼虫心脏的正确对齐。
- 用指甲油在盖玻片边缘将其固定，并小心地在盖玻片之间加入 20–30 μl Vectashield，填满空隙。
- 用指甲油密封，于 4°C 保存，或长期保存时置于 -20°C。
代表性结果
若操作正确，背血管的所有组分及其相关组织应保持完整，并可清晰观察。背景荧光应尽可能弱。在成虫中，腹侧纵行肌层染色效果良好，可产生较强的信号（图1和图2）。然而，其下方的环形心肌细胞产生的信号强度通常不及覆盖其上的腹侧肌层。成虫心脏前部“圆锥室”的心肌细胞含有大量收缩物质，因此该区域相较于心脏管的其余部分显得最为发达。幼虫心脏的心肌纤维排列呈螺旋状，与成虫收缩性心肌细胞的排列相似（图3）。
图1： 上图。一幅荧光显微图像，显示表达肌球蛋白-GFP的成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的完整心脏管结构。图像使用配备Apotome滑动模块的蔡司Imager Z1荧光显微镜拍摄。肌球蛋白-GFP显示为绿色，肌动蛋白用AlexaFluor® 594鬼笔环肽染色（红色），α-辅肌动蛋白则用抗α-辅肌动蛋白抗体标记（蓝色）。请注意，该制备方法可获得结构保存良好的心脏样本。CC = 锥形心室；AM = 悬肌；V = 内部瓣膜；VLL = 腹侧纵肌层。下图。从锥形心室（CC）至心脏第三腹节、位于腹侧纵肌层下方的一段成年心脏管区域，显示收缩型心肌细胞中肌原纤维的螺旋状排列结构。请点击此处查看图1a的放大版本，点击此处查看图1b的放大版本
图2： 使用AlexaFluor® 594鬼笔环肽（红色）和抗Pericardin（IV型胶原）抗体（绿色）染色的成年果蝇心脏前部代表性共聚焦图像序列。Pericardin沿腹侧表面与心脏相关，可能起源于腹侧肌层中纵向排列的肌原纤维。请点击此处查看图2的放大版本。
图3：三龄 Drosophila 幼虫心脏主部A7节段的荧光显微图像。该图像使用配备Apotome滑动模块的蔡司Imager Z1荧光显微镜拍摄。肌动蛋白用AlexaFluor® 594鬼笔环肽（绿色）标记，α-辅肌动蛋白用抗α-辅肌动蛋白抗体（红色）染色。请点击此处查看图3的放大版本。
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讨论
本文介绍了一种用于制备和染色的实验方案 黑腹果蝇 背血管及相关组织的荧光或共聚焦显微镜成像。我们简要介绍了经本实验室优化并常用的有效染色步骤，以实现清晰分辨的染色结果 原位 幼虫和成体成像 黑腹果蝇 心管。其他人也以简略形式描述过类似方法2, 3, 4.
实施染色程序时，还需考虑一些重要的附加细节。例如，与其他生物材料类似，Drosophila 心肌纤维在固定后原本较为柔韧的组织会变得相当脆。尤其值得注意的是附着在心脏管上的多对支持性悬韧纤维，其结构极为脆弱5, 6, 7。因此，尽量减少不必要的操作可降低对固定组织的物理应力和直接损伤，从而提高观察到保存良好且完全完整结构的可能性。此外，仅在成虫样本外骨骼的最边缘区域进行操作，可最大限度地减少对组织的干扰。
还必须注意，本方案的步骤仅可视为成功进行幼虫和成虫黑腹果蝇（Drosophila）心脏免疫染色的初步起点。本方法已简化为本实验室常用试剂...
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致谢
作者感谢 S.I. Bernstein（圣地亚哥州立大学）对本文稿撰写工作提出的宝贵意见和建议。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）向 S.I. Bernstein（圣地亚哥州立大学）和 R. Bodmer（BIMR）提供的资助，以及美国心脏协会西部地区分会向 G. Vogler 和 A. Cammarato 提供的博士后奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’，N’四乙酸（EGTA） | 试剂 | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| 甲醛，10%，无甲醇，超纯 | 试剂 | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594鬼笔环肽 | 试剂 | Invitrogen | A12381 | |
| Vectashield® 含DAPI的荧光封片剂 | 试剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 钨针 | 试剂 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 针持 | 试剂 | Fine Science Tools | 26018-17 |
参考文献
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
- Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J Neurosci. 2, 271-280 (2005).
- Zeitouni, B. Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila. PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).
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- Taghli-Lamallem, O. Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype. Aging Cell. 2, 237-249 (2008).
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- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 7150, 151-156 (2007).
- Mery, A. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).
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重印与许可
