荧光标记 黑腹果蝇 心脏结构

摘要

本文介绍了一种对幼虫和成虫黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）心脏管不同组分进行荧光标记的基本实验方案。这些样本适用于荧光显微镜或共聚焦显微镜成像。该技术可对这一强大模式生物的心脏结构特征进行详细的形态学分析。

摘要

TheDrosophila melanogaster背血管，即心脏，是一种管状结构，由单层收缩性心肌细胞、沿心壁两侧排列的围心细胞、支持性的翼状肌以及在成虫中还有一层腹侧纵行肌细胞组成。收缩纤维中含有肌肉细胞骨架的保守组分，包括紧密排列的肌原纤维束以及细胞骨架/膜下蛋白复合物，这些组分与细胞外基质中的同源成分相互作用。本文中，我们描述了一种对解剖所得幼虫及半完整成虫心脏中的特定心肌组分进行固定和荧光标记的实验方案。Drosophila. 具体而言，我们展示了在幼虫心脏中标记肌节中的F-肌动蛋白和α-辅肌动蛋白的方法。此外，我们在表达肌球蛋白-GFP的成年果蝇中对F-肌动蛋白和α-辅肌动蛋白进行标记，并在野生型成年果蝇心脏中对α-辅肌动蛋白以及IV型细胞外基质胶原蛋白——层粘连蛋白（pericardin）进行标记。本实验特别关注一种用于半完整成年心脏的封片策略，该策略可最大限度减少操作步骤，优化维持心脏管及其相关组织完整性的机会。这些样品适用于荧光显微镜和共聚焦显微镜成像。总体而言，该方法使得研究者能够对这一遗传操作性强的模式生物系统中心脏的结构特征进行细致而深入的分析。

方案

开始之前

1. 配制以下溶液：
   1. 松弛缓冲液（含 10 mM EGTA 的人工 Drosophila 血淋巴（ADH）（参见“在 Drosophila 中观察跳动的心脏”）
   2. 固定液（含 4% 甲醛的 1× PBS）
   3. PBSTx（含 0.1% Triton-X-100 的 PBS）
   4. 用 PBSTx 适当稀释的一抗及种属特异的荧光标记二抗
2. 解剖 Drosophila 以暴露心脏管（成虫和/或幼虫），操作步骤如下：
   1. 参照“在 Drosophila 中观察跳动的心脏”中的半完整 Drosophila 心脏制备方案，或
   2. Drosophila 幼虫神经肌肉接头解剖方案¹，并作如下修改：幼虫解剖过程中使用充氧的 ADH，并将后端固定针略微偏离腹侧中线。沿腹侧中线剪开幼虫。固定前不要移除任何组织。

荧光染色....

讨论

本文介绍了一种用于制备和染色的实验方案 黑腹果蝇 背血管及相关组织的荧光或共聚焦显微镜成像。我们简要介绍了经本实验室优化并常用的有效染色步骤，以实现清晰分辨的染色结果 原位 幼虫和成体成像 黑腹果蝇 心管。其他人也以简略形式描述过类似方法^{2, 3, 4}.

实施染色程序时，还需考虑一些重要的附加细节。例如，与其他生物材料类似，Drosophila 心肌纤维在固定后原本较为柔韧的组织会变得相当脆。尤其值得注意的是附着在心脏管上的多对支持性悬韧纤维，其结构极为脆弱^{5, 6, 7}。因此，尽量减少不必要的操作可降低对固定组织的物理应力和直接损伤，从而提高观察到保存良好且完全完整结构的可能性。此外，仅在成虫样本外骨骼的最边缘区域进行操作，可最大限度地减少对组织的干扰。

还必须注意，本方案的步骤仅可视为成功进行幼虫和成虫黑腹果蝇（Drosophila）心脏免疫染色的初步起点。本方法已简化为本实验室常用试剂.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’，N’四乙酸（EGTA）	试剂	Sigma-Aldrich	E4378
甲醛，10%，无甲醇，超纯	试剂	Polysciences, Inc.	50-00-0
Triton-X-100	试剂	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Alexa Fluor® 594鬼笔环肽	试剂	Invitrogen	A12381
Vectashield® 含DAPI的荧光封片剂	试剂	Vector Laboratories	H-1200
钨针	试剂	Fine Science Tools	26002-10
针持	试剂	Fine Science Tools	26018-17