我们开发了一种半自动光学心跳分析方法（SOHA），用于分析来自高速光学记录的数据 果蝇斑马鱼和小鼠胚胎心脏。我们展示了本方法在果蝇和小鼠胚胎心脏功能分析中的应用。
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本文内容
摘要
摘要
我们开发了一种用于分析高速光学记录数据的方法Drosophila，斑马鱼和胚胎小鼠心脏（Fink 等，2009）。我们的半自动光学心跳分析（Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis, SOHA）采用一种新颖的运动检测算法，能够检测与单个收缩和舒张事件相关的心脏运动。该程序提供一系列生理学上相关的重要读数，包括收缩期和舒张期时长、心率，以及心跳节律异常的定性和定量指标。程序还可测量舒张期和收缩期的心脏直径，并据此计算缩短分数和面积变化分数。输出结果以数字文件形式提供，兼容大多数电子表格软件。该系统对记录中的每一次心跳均进行测量，从而提高输出结果的统计效力。我们展示了用户需要输入操作的每一步骤，并演示了本方法在全部三种遗传学上可操作的心脏模型中心功能分析的应用。
方案
半自动光学心跳分析
1. 预处理 -
此步骤提供有关舒张期和收缩期心径的信息。
在心脏舒张末期和收缩末期识别并标记心缘。光学记录可缓慢推进，甚至逐帧播放，从而精确定位心脏最大收缩和最大舒张发生的帧图像。分别标记一对舒张期心缘和一对收缩期心缘。也可在心脏不同水平位置重复进行标记。
此步骤中获得的心脏直径还可用于计算另一项指标，以评估心脏的收缩功能。该指标为左室短轴缩短率（%FS），反映心脏收缩时心壁边缘相互靠近的程度。计算 %FS 的公式如下：
(((舒张期内径 - 收缩期内径) / 舒张期内径) × 100)
注意——本组中确定的点仅用于直径和缩短分数的测量，不用于运动检测。
示例：在果蝇（Drosophila）中，肌球蛋白重链的转导结构域（已知可调节该马达蛋白酶活性的区域）若发生点突变，会导致心脏扩张或受限，具体表现取决于突变是抑制还是增强肌球蛋白的ATP酶活性（Cammarato等，2008）。由于通常无法透过包围心脏的体壁和脂肪组织识别整个心脏管全长的心脏边界，因此无法在完整活体果蝇中进行此类测量（可比较下文“M型图”中的野生型、D45和Mhc5的M型图像）。利用其他常用方法在完整果蝇中观察心脏时，所进行的测量通常仅限于心脏最前端的部分，即锥形腔区域。此外，在固定组织中也无法获得此类动态测量结果。
2. 运动检测-
此步骤由程序自动完成，采用两种不同的算法来分析每部视频中的运动情况。简而言之，第一种算法为“平均帧暗度”算法，采用逐帧分析的方法。该算法计算视频每一帧整体的暗度强度平均值，将该值归一化至0到1之间的区间，并随时间绘制视频中每一帧的归一化平均值曲线。第二种方法为“逐像素”算法，分析从一帧到下一帧所有单个像素暗度的变化情况。对于每个帧，统计暗度变化超过预设阈值的像素数量，并随时间绘制视频中每一帧的该数值曲线。
3. 检查间隔-
本模块中显示了两种运动检测算法的输出结果，“平均暗度”输出窗口位于“逐像素”输出窗口的上方。为了确保检测到的时间区间与实际视频中的运动一致，我们在算法输出窗口正下方直接显示由所分析帧生成的边缘轨迹图或M型超声图（M-mode）。该M型图是通过对视频中每一帧的心脏区域进行数字切割，获取宽度为一个像素的切片，并将其水平排列而成，从而提供心脏边缘随时间运动的快照。在“逐像素”窗口中，识别出的舒张期区间以一条水平绿色线条表示，其上方数字表示参与该区间的帧数。收缩期区间定义为两个连续舒张期之间的区间。收缩期的起始点在M型图中以一条垂直蓝色线条表示，终点则以一条垂直红色线条表示。通过此显示方式，可以较为直观地判断算法输出结果是否与实际的心脏运动相符。
尽管运动检测是自动完成的，但仍必须检查输出结果的准确性。原因有多种：其一是光照水平常存在与心脏运动无关的缓慢波动，这种波动通常可通过内置的高通滤波器消除。第二个原因与“逐像素”分析方法的敏感性有关。该算法的输出通常包含两条运动轨迹，分别对应收缩运动和舒张运动。在老年果蝇及某些突变体中，这两次运动之间的时间间隔相对较长，程序可能会将这两次运动误判为两次独立的心跳。通过点击“使用亮度”复选框，可让程序将逐像素算法的输出结果与平均帧亮度算法的结果进行比对，从而纠正这一问题。
示例（参见视频）：在5至7周龄的果蝇中，收缩间期通常比年轻果蝇长得多。这些较长的间期最初会被检测为两次独立的收缩，中间由短暂的舒张期分隔。此问题可通过选中“使用暗度”复选框来纠正。在此情况下，程序会将“逐像素”算法识别出的舒张期与“平均帧暗度”输出进行比较。如果“平均帧暗度”输出值为正，则“逐像素”算法中识别出的任何舒张期都将被忽略，从而正确划分收缩间期。整个视频可按每10秒一段进行扫描，并点击“数据OK”接受或点击“丢弃数据”拒绝。在使用暗度算法时，可手动调整高通和低通滤波器的灵敏度，以更准确地界定收缩间期。
4. 输出统计-
当某一影片的输出结果被接受后，程序将利用该信息自动计算多个参数，包括舒张期和收缩期间隔、心动周期和心率、收缩波的传播方向和速度、心脏直径以及%FS。此外，程序还提供多种量化心律不齐的方法，以反映非均匀的收缩和舒张周期（参见 Fink 等，2009）。每个影片的统计结果以及整个数据集的汇总结果均以逗号分隔值（.csv）文件形式提供，可在 Microsoft Excel 等电子表格程序中打开。
表1-
半自动光学心脏分析程序生成结果的示例。
5. 更新直方图-
该程序部分以直方图形式显示数据集中所有心率间期的数据。由于心率具有变异性，我们对直方图输出数据进行归一化处理。然而，由于间期的分布并不围绕均值对称，因此我们采用中位数间期值进行归一化。
示例（参见视频）：KCNQ 钾离子通道突变的果蝇表现出极度不规则的舒张期和收缩期间隔。通常情况下，其收缩期间隔比同龄野生型果蝇更长且更不规则。通过直方图形式展示数据可清晰观察到这一现象（另见 Ocorr 等，2007）。
6. M型超声-
该模块可从视频帧中心脏的任意位置生成M型超声图像，并且还可以指定M型超声图像的长度。M型超声有助于定性地显示心脏在视频中的活动情况。
示例（参见视频）：一条3日龄斑马鱼幼体心脏的动态影像，显示用于生成M型超声的前部心室。每帧影像中将被电子裁剪的垂直像素切片由一条红线标示。
M型图：果蝇和斑马鱼M型图的示例。在预处理步骤中讨论的肌球蛋白突变之一会导致分子马达的酶动力学加快，从而引起心脏收缩受限，偶尔还会出现传导阻滞。这两个参数均可通过M型图进行定性展示。
在野生型和突变型果蝇心脏相同部位生成的M型图清晰地显示了Mhc5 突变体的心脏收缩受限表型，以及D45突变体（表达酶动力学降低的肌球蛋白）的心室扩张直径和心律失常的收缩周期（改编自Cammarato等，2008）。
由斑马鱼幼体心脏生成的M型超声图像，显示前部心室（与演示中所示为同一心脏电影，Fink等，2009）。
7. 红点电影-
该模块会自动生成一段分析后视频的慢速（1:4）版本，持续20秒，显示所有被识别为发生变化的像素，以红色标出。此功能主要用于示意图解。
视频 1 - 一个“红点视频”，显示了程序算法识别出的具有暗度强度变化的像素，以红色标示。该视频速度比原始速度减慢了4倍。
点击此处下载视频 1。
8. 其他应用
我们已开始将该分析系统应用于其他具有小型心脏的模型的高速影像分析，这些模型通常难以用传统方法进行分析。我们已成功将该分析方法应用于斑马鱼幼体心脏和小鼠胚胎心脏（Fink 等，2009）。
视频 2 - 小鼠心脏视频及带有数据输出的检查间期图示。
点击此处下载视频 2。
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讨论
果蝇模型已被证明是一种强大的遗传学工具，已被用于解决从胚胎发育到学习与记忆等多种科学问题。近年来，这种多功能的模式生物被用于研究心脏功能的遗传机制。目前已有多种尝试通过观察完整果蝇腹部体壁来量化成年果蝇的心脏生理活动。这些方法大多依赖于视觉观察或记录穿过腹部的光强变化，以量化单一参数——心率。尽管这一参数具有一定的应用价值，但它在反映心脏功能方面存在局限性。我们的半自动化光学心跳分析方法是一种可靠的技术，能够从心脏跳动的高速影像中精确提取多个重要参数的信息，并可对记录中的每一次心跳进行分析。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
KO 和 AC 得到美国心脏协会提供的一项资助和一项奖学金的支持。SIB 和 RB 得到美国国立卫生研究院（NIH）资助项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MatLab 软件 | Mathworks | 分析软件所需的运行环境。 | |
| EM-CCD 数字相机 | Hamamatsu Corp. | 9100 或 9300 | 其他高速数字相机也可使用。 |
| HC 图像采集软件 | Hamamatsu Corp. | 其他可生成 avi 格式视频的图像采集软件也可使用。 | |
| 配备 10x 物镜的显微镜 | Leica Microsystems | 使用浸水镜头消除空气-水界面可显著提高分辨率 |
参考文献
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
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重印与许可
