介观荧光断层成像技术 体内 发育过程成像 果蝇

摘要

介观荧光断层成像技术突破了组织切片荧光显微镜的穿透深度限制。该技术基于多角度投影照明和光子传输模型描述。我们展示了在活体中对表达GFP的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）翅成虫盘形态发生过程进行全身体积三维可视化。

摘要

观察器官发育形成过程以及疾病的发生与治疗，通常高度依赖于在完整活体生物体内对分子和功能变化进行光学检测的能力。大多数现有的光学成像方法在成像尺度上存在局限，无法覆盖现代光学显微镜的穿透深度极限（0.5–1 mm）与光学宏观成像受扩散限制的尺度（>1 cm）之间的范围[1]。因此，许多重要的模式生物，例如昆虫、动物胚胎或小型动物的四肢，仍难以进行活体光学成像。

尽管人们对开发纳米级分辨率的光学成像方法的兴趣日益增加，但在提高成像穿透深度方面却鲜有成功进展。事实上，实现超越显微镜限制的活体成像面临着组织中光子散射所带来的困难。例如，近期对整个胚胎进行成像的研究[2,3]需要对样本进行特殊的化学处理以清除散射成分，这一过程使其仅适用于死后成像。然而这些方法表明，在发育生物学和药物发现等领域，迫切需要对大于双光子显微镜或共聚焦显微镜通常可容纳的样本进行成像。

我们开发了一种名为介观荧光断层成像（Mesoscopic Fluorescence Tomography）[4] 的新型光学成像技术，适用于尺寸范围为1 mm至5 mm的无创活体成像。该方法以分辨率换取穿透深度，但提供了前所未有的断层成像性能，并旨在通过实现对荧光标记响应随时间演变的成像能力，将“时间”作为发育生物学观察（以及其他可能的生物研究领域）中的一个新维度引入。因此，该技术可加速研究基因突变或外界刺激对形态或功能的影响，更重要的是，通过允许对同一发育中的生物体进行长期延时可视化，能够完整捕捉发育过程或组织功能的全貌。

该技术利用改进的实验室显微镜和多角度投影照明，从360度的投影方向采集数据。它采用费米简化法求解福克-普朗克光子输运方程，并结合几何光学原理，构建适用于介观尺度的精确反演方案。该方法可实现对尺寸达数毫米的样品中不透明三维结构进行活体全身可视化成像。

我们通过在体内成像发育中的Drosophila组织的三维结构，以及连续六小时实时观察不透明的果蝇蛹翅膀形态发生过程，验证了该技术的体内性能。

方案

本实验中使用的Drosophila melanogaster品系如下：

• elav-Gal4 (FBti0002575)
• ap-Gal4md544 (FBal0051787)
• UAS-srcEGFP (FBti0013990)
• w1118 (FBal0018186)

在所有实验中，均使用 UAS-Gal4 系统在目标组织（即唾液腺或翅成虫盘）中过表达 GFP。具体而言，将携带适当 Gal4 的转基因雌蝇与携带 UAS-EGFP 的转基因雄蝇杂交。杂交后代在 25°C 的恒湿培养箱中培养。当试管中开始出现蛹（杂交后约 5–6 天）时，在白色前蛹期（蛹壳形成后 0–1 小时）根据 GFP 荧光信号筛选个体，并用于断层成像。

1. 设置适当的杂交组合，并在 25°C 下培养
2. 杂交开始后 5-6 天，挑选荧光后代用于成像。使用湿润的画笔轻轻将白色未成熟蛹从瓶壁上移除。
3. 将未成熟蛹置于培养皿中的水滴或 PBS 中，以去除食物残渣以及覆盖在蛹壳上导致样本自发荧光的胶状物。用画笔轻轻清洗。若需使蛹继续发育，可将选中的白色未成熟蛹置于含有湿润滤纸（湿润环境）的培养皿中，或放置在装有果蝇培养基的洁净培养瓶壁上。这将确保足够的湿度，以支持动物正常发育。

Drosophila 样品制备

1. 将蛹壳的底部粘贴到毛细玻璃管（800 微米直径）中，使果蝇的前后轴与管子方向平行。
2. 将毛细玻璃管垂直固定在旋转台上。
3. 调节旋转台的倾斜轴，使旋转轴与成像 CCD 的像素列平行。

正向模型的确定

1. 将蛹固定在毛细玻璃管中，并按先前所述方法安装
2. 用二氧化硅毛细管（100 微米，外径）装入荧光染料（Cy5.5）
3. 将毛细管以相对于前后轴 45 度的角度插入蛹体内
4. 使用低数值孔径透镜，以激发激光束照射蛹，并围绕其垂直轴旋转 360 度，采集透射荧光图像
5. 采用适当的前向模型对实验数据进行拟合

唾液腺成像

1. 按照先前所述方法，固定唾液腺中表达GFP的蛹
2. 用激发光束照射，并在透射照明下收集围绕蛹垂直轴旋转360度时的GFP荧光信号
3. 利用前向模型重建所获取的数据

延时成像

1. 将表达GFP的白色预蛹固定，使其翅成虫盘可见
2. 保持成像环境湿润并处于室温，以避免蛹体脱水
3. 设置快门以避免持续光照
4. 使用激发光束照射，并通过透射照明方式在360度范围内收集荧光信号，同时沿蛹体垂直轴旋转样本
5. 利用前向模型对所获取的数据进行重构

组织学

1. 在 1x PBS 中解剖唾液腺、中枢神经系统/眼原基。
2. 用 4% 多聚甲醛、1x PEM（100 mM Pipes，1 mM EGTA，1 mM MgCl₂）在室温下固定组织 20 分钟。
3. 去除固定液，用含 DAPI 的 Vectashield 封片（Vector）。
4. 用荧光显微镜观察成像。

延时组织学

1. 收集白色预蛹，并将其置于湿润培养皿中进行发育阶段同步。
2. 收集处于不同发育阶段的蛹。
3. 在固定前，用细针（昆虫针 000，FST）在蛹壳上刺两下（0 小时蛹壳形成后，APF）。
4. 将蛹在含 8% 甲醛的 1×PEM 缓冲液中固定 6–8 小时，室温下轻轻振荡。
5. 去除固定液并用 1×PBS 洗涤后，用锋利刀片沿垂直于前后轴（A/P 轴）方向将固定后的蛹切成两部分；
6. 将两部分组织浸入含 DAPI 的 Vectashield 封片剂（Vector）中，置于载玻片（Lab-Tek）上进行封片，用于成像。
7. 使用荧光共聚焦显微镜采集图像。

图1. 请点击此处查看图1的放大版本。

讨论

体内重建表达GFP的蛹壳及唾液腺 D. melanogaster 预蛹期（比例尺：500 微米）及其相应的组织学图像（蓝色：DAPI 染色；绿色：GFP 荧光）如图 1(a) 所示。延时序列成像的 D. melanogaster 翅成虫盘的图像如图1(b)所示。图像来自同一个活体样本，在四个不同时间点（0、3.0、3.5 和 6.5 小时）采集。第一列显示相对于蛹背侧视角0度的一个投影图像。第二列的重建图像对应于红线条指示的切面。最后，第三列展示了与组织学切片的对比。显然，组织学样本与断层重建结果高度吻合。(c) 为一个平面图像 果蝇的 蛹壳和表达GFP的唾液腺。