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方法文章

用于真菌毒素检测的ELIME（酶联免疫磁电化学）方法

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DOI：

10.3791/1588

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2009年10月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Sciences and Chemical Technologies, University of Rome, Tor Vergata

本文内容

摘要

本文演示了一种基于新型竞争性免疫化学方法并结合最终电化学检测技术来检测与人类健康相关的镰刀菌毒素（霉菌毒素）的实验方案。

摘要

免疫分析法是检测食品中危险真菌毒素的一种有效替代方法，相较于成本更高且耗时更长的定量高效液相色谱（HPLC）或气相色谱（GC）1, 2 方法，更适合用于筛查。在本实验方案中，我们展示了如何构建并实施一种基于磁珠作为免疫化学反应固相载体、丝网印刷电极作为传感平台的电化学竞争性酶联免疫磁分析法3。

本方法旨在测定HT-2和T-2毒素的总量，这两种毒素属于单端孢霉烯族真菌毒素，对人类健康具有重要危害4。采用一种对HT-2和T-2毒素交叉反应性均为100%的抗体克隆，可同时以相似的灵敏度检测这两种毒素5。

本实验的第一步是包被步骤，即将HT2-KLH偶联毒素固定在磁珠表面。随后进行封闭步骤，以避免非特异性吸附。接着加入单克隆抗体，使固定化的HT-2与样品或标准溶液中游离的HT-2或T-2之间发生竞争反应。

竞争步骤结束时，与固定的HT-2结合的单克隆抗体的量将与样品溶液中毒素的含量成反比。

使用碱性磷酸酶（AP）标记的二抗来检测特异性抗体与固定的HT-2之间的结合反应。最终检测步骤是将一份对应特定样品或标准溶液的磁珠悬浮液滴加到丝网印刷工作电极表面；通过精确放置在丝网印刷电极正下方的磁铁固定并富集磁珠。磁珠与AP底物孵育两分钟后，采用差分脉冲伏安法（DPV）使用便携式仪器（PalmSens）检测酶促反应产物，该仪器还可自动在数秒内连续启动八次测量。

方案

1）封闭包被的磁珠：

按照以下步骤封闭包被的磁珠：

  1. 准备一组 2 ml 的 Eppendorf 管；
  2. 使用样品旋转混合器对包被的磁珠进行匀浆（轻轻振荡，不可涡旋）（包被磁珠的制备方法见附录）；
  3. 匀浆后立即用移液器将 10 μl 包被磁珠分别加入各个 Eppendorf 管中；
  4. 向每支 Eppendorf 管中加入 1 ml 脱脂奶粉封闭液；
  5. 将磁珠在旋转混合器上室温孵育 30 分钟；
  6. 去除封闭液：将 Eppendorf 管置于磁力架中，磁铁吸附 2 分钟（可见磁珠吸附于管壁一侧），小心吸取上清液，避免扰动磁珠；
  7. 每管中加入 1 ml 含 NaN3 和 BSA 的 PBS 缓冲液作为储存液；
  8. 将包被并封闭后的磁珠于 4°C 保存（请注意：包被磁珠在 4°C 下至少可稳定保存 2 个月）；

2) 用于构建标准曲线及样本分析的磁珠免疫链

按照以下步骤操作，使磁珠准备好用于测量：

  1. 为待分析的每份样品提取液准备一个 Eppendorf 管（2 ml），内含包被和封闭溶液；
  2. 为每种工作校准溶液额外准备一个 Eppendorf 管；
  3. 使用前，在旋转样品混合器上将磁珠均质化 2 分钟；
  4. 使用磁性颗粒浓缩器去除保存液体；
  5. 用 PBS/BSA 洗涤液将磁珠洗涤三次，去除洗涤液；
  6. 竞争步骤：向每个含有洗涤后磁珠的管中加入 200 μl 制备好的样品提取液；每个样品使用一个磁珠管。对每种标准溶液重复相同操作。向每个磁珠管中加入 200 μl 单克隆抗体溶液。将磁珠在室温下置于旋转样品混合器上孵育半小时；
  7. 从 Eppendorf 管中移除用于竞争步骤的溶液；
  8. 标记步骤：向每个磁珠 Eppendorf 管中加入 400 μl 标记的二抗溶液。将磁珠在室温下置于旋转样品混合器上孵育半小时；
  9. 从 Eppendorf 管中移除标记溶液；
  10. 用 PBS/TWEEN® 20 洗涤液将磁珠洗涤三次，去除液体；
  11. 每份磁珠 aliquot 用 100 μl DEA 缓冲液重悬。此时磁珠已准备好进行电化学检测步骤；

3) 带有多路复用器（Mux）选项的 PalmSens 装配

请注意：底物水解的酶促产物会污染电极表面；因此每次测量都需要使用新的电极。

  1. 通过串行电缆将 PC 笔记本电脑连接至 PalmSens；
  2. 将 CH8 多路复用器的 9-DIN 插头与 PalmSens 连接；
  3. 将八通道 Mux 电极接口的串行电缆连接至 CH8 多路复用器；
  4. 将电极条放置在八个磁铁块上。注意将每个磁铁置于各工作电极下方（需特别注意，每个电极必须使用单独的磁铁，否则磁性颗粒将无法集中在工作电极区域）；
  5. 将电极条插入八通道 Mux 电极接口中；

进行微分脉冲伏安法（DPV）测量时，在相应位置使用以下参数：
起始电位（E begin）：0 (V)；终止电位（E end）：0.6 (V)；电位步长（E step）：0.016 (V)；脉冲电位（E pulse）：0.0339 (V)； conditioning 电位（E conditioning）：0 (V)；沉积电位（E deposition）：0 (V)；扫描速率（Scan rate）：0.1 (V/s)；脉冲时间（T pulse）：0.06 (s)；conditioning 时间（T conditioning）：0 (s)；沉积时间（T deposition）：0 (s)；平衡时间（T equilibration）：8 (s)。

4) 酶促反应与电化学检测

  1. 轻轻振荡每个含有磁珠的离心管，使其充分混匀，这些磁珠已准备好用于电化学测量步骤，以获得均匀分散的磁珠悬浮液；
  2. 从每个Eppendorf管中在均质化后立即移取一份等分试样 20 μl 将磁珠分散液加样至相应的工作电极表面。对于每条上的每个电极，均需使用 20 μl 来自不同离心管的磁珠（例如，使用八个电极时，取八个不同的离心管）；
  3. 添加 80 μl 在第一个电极上加入酶底物溶液。开始2分钟倒计时。14秒后，加入 80 μl 在第二个电极上加入酶底物溶液。再过14秒后，加入 80 μl 在第三个电极上加入酶底物溶液。以相同的时间间隔（14秒）依次操作至最后一个电极（即：每隔14秒加入一份底物溶液）。14秒的时间间隔是根据恒电位仪完成一次测量所需时间计算得出的；需要注意的是， 80 μl 每个传感器上的溶液应覆盖工作电极、参比电极和对电极。此外，各传感器的溶液不得与相邻电极的溶液相互接触。
  4. 在首次加入酶底物溶液后的2分钟倒计时结束后，开始电化学测量；
  5. 使用 PalmSens Lite 软件获取电流峰（μA每种溶液的）

5）计算

使用四参数逻辑方程建立校准曲线，并计算每个含有未知样品的离心管中HT-2/T-2毒素总量的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。

实验数据需采用非线性四参数逻辑斯蒂（4-PL）方程图（1）进行拟合（可使用 Sigma Plot 8.0 或 Kaleidagraph 软件），以峰高（μA）对校准品浓度（ng/ml）作图。非线性 4-PL 模型通常用于描述配体结合分析（LBAs）6。

Logistic growth equation, \( y = \frac{a}{1+\left(\frac{x}{x_{0}}\right)^{b}} + y_{0} \), mathematics formula.(1)
a、b、x₀、y₀ 为 Sigma Plot 曲线拟合程序提供的 logistic 参数。
使用上述公式计算稀释后样品提取液中 HT-2/T-2 毒素总量的含量。
Mathematical formula for static equilibrium; logarithmic transformation; physics concept diagram.(2)
x 表示稀释提取液中 HT-2/T-2 毒素总量的质量浓度，由四参数 logistic 方程计算得出，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
y 表示未知样品测得的电流值，单位为微安（μA）

附录

6) 包被磁珠

按照以下步骤操作以获得包被的磁珠：

洗涤步骤

  1. 通过振荡和涡旋（最大速度）1分钟，使甲苯磺酰活化的 Dynabeads® M-280（储存液浓度为 2 × 10⁹ 个微球/mL）充分混匀（避免产生泡沫）（请注意，为确保测量结果的可重复性，磁珠的浓度必须始终保持一致）；
  2. 立即用移液器将1 mL上述混匀后的磁珠转移至2 mL离心管中；
  3. 将离心管放入磁性粒子浓缩器中，开启磁铁部分，静置2分钟（可见磁珠吸附在管壁一侧）；
  4. 小心吸除上清液，注意不要扰动磁珠；
  5. 将离心管从磁性粒子浓缩器中取出，加入1 mL 0.1 M 硼酸盐缓冲液（pH 9.5），在旋转混样仪中轻柔混匀2分钟；
  6. 吸除上清液；
  7. 向离心管中加入1 mL硼酸盐缓冲液，磁珠现可进行包被步骤；

包被步骤

  1. 将600 ml HT-2与KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）偶联的储备液加入1 ml磁珠中（HT-2-KLH终浓度为375 mg/ml）；在37°C*下于旋转样品混合仪上缓慢倾斜旋转孵育20小时；
  2. 孵育结束后，将管子置于磁性粒子浓缩器中，用移液器吸去上清液；
    用1 ml PBS/BSA缓冲液溶液洗涤包被磁珠两次。每次洗涤后均需去除PBS/BSA溶液。所有洗涤步骤均在旋转混合仪上设置磁珠与PBS/BSA缓冲液混合5分钟完成；
  3. 使用1 ml TRIS/BSA缓冲液溶液洗涤磁珠一次。去除TRIS/BSA溶液。此步骤在37°C*下于旋转混合仪上设置磁珠与TRIS/BSA缓冲液混合4小时完成；
  4. 使用1 ml新配制的（置于4°C冰箱中保存）PBS/BSA缓冲液溶液洗涤磁珠一次。去除PBS/BSA溶液。此步骤在室温下于旋转混合仪上设置磁珠与PBS/BSA缓冲液混合5分钟完成；
  5. 洗涤步骤完成后，彻底去除所有洗涤液，并加入1 ml PBS缓冲液 + NaN3 + BSA作为储存液；
  6. 将包被磁珠储存于4°C（请注意：包被磁珠在4°C下至少可稳定保存2个月）；

*为此，可将混匀仪置于带有孔洞的烘箱中，该孔洞允许电源线插入。或者，也可将混匀仪放置在37°C的恒温室内。

7）样品制备与提取

称取25 g精细研磨的样品（婴儿食品或早餐谷物）至搅拌机杯中，加入100 ml乙腈/水溶液（86/14），在高速搅拌机中提取3分钟。在4000 rpm（3000 g）下离心5分钟后，取8 ml上清液，用Mycosep柱净化，取4 ml净化后的提取液，在氮气流下吹干。干燥后的样品可在-30 °C下保存数月。

8) 样品重悬

早餐谷物

用40 ml pH 7.4的PBS缓冲液重新溶解干燥的早餐谷物提取物（以谷物为基础、供成人食用的食品）。通过此方法，毒素浓度等于假设法定限值（200 ng/g）的样品在检测步骤中产生的信号将位于工作范围的中间位置。

婴儿食品

用4 ml PBS重新溶解干燥的婴儿食品提取物（供婴儿食用的谷物类食品）。通过此方法，毒素浓度等于假设法定限值（20-25 ng/g）的样品在检测步骤中将产生位于检测工作范围中点的信号。

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讨论

抗体作为生物分子识别探针的应用已在传感技术中得到广泛使用；如今，免疫化学检测方法（如ELISA和MEIA）是许多实验室中最常用和应用最广泛的平台之一7。

尽管这些方法已实现了极高的灵敏度和特异性，但近年来许多研究团队的主要目标一直是进一步改进和优化其性能。

在本实验方案中，我们展示了如何制备和检测用于真菌毒素检测的电化学免疫传感器。我们认为，利用电化学方法开发基于免疫的传感器在未来将变得越来越重要。这主要是因为电化学检测相比光学检测具有固有的优势。事实上，电化学检测更不易受到干扰，对非特异性吸附具有显著的抗干扰能力，即使在早餐谷物和婴儿食品等复杂样品基质中也能表现出良好的性能。此外，电化学方法更易于实现微型化，并适用于多阵列集成设计。

将该方法与磁性纳米颗粒结合，也提高了分析性能，并已证明特别适用于食品样品中污染物的检测。

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致谢

作者感谢罗马“托尔维加塔”大学分析化学实验室的Nancy Downer及所有成员提供的合作与后勤支持。本工作由欧盟项目“BioCop”资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钾Sigma-AldrichP9333
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP9791
磷酸氢二钠Sigma-AldrichS3264
氯化钠Sigma-AldrichS3014
MgCl2 无水Sigma-AldrichM8266
二乙醇胺（99.5%）Sigma-Aldrich31589
盐酸 37%Sigma-Aldrich320331
H3BO3Sigma-AldrichB6768
三（羟甲基）氨基甲烷Sigma-Aldrich252859
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA4503
NaOHSigma-AldrichS5881
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416
NaN3Aldrich71290
1-萘基磷酸二钠盐FlukaN7255
脱脂奶粉封闭液 — 无脂干奶粉Bio-Rad170-6404
与 KLH（钥孔血蓝蛋白）偶联的 HT-2，储备液（1 mg/ml PBS）：Biopure004050HT-2-KLH 偶联物通过 CDI 法制备，其中 HT-2 毒素 3 和 4 位上的游离 OH 基团被 N,N'-羰基二咪唑（CDI）活化，活化后的 HT-2 毒素与蛋白（KLH）的氨基反应，形成稳定的氨基甲酸酯键。
标记二抗：马来源抗小鼠 IgG（H+L），与碱性磷酸酶偶联，浓度 1 mg/ml。Vector LaboratoriesAP-2000
HT-2 毒素Biopure
磁珠：Dynabeads®InvitrogenM-280 Tosylactivated浓度为 2 × 109 珠/ml。
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4将 0.20 g 氯化钾、0.20 g 磷酸二氢钾、1.16 g 磷酸氢二钠和 8.00 g 氯化钠溶于 900 ml 水中
二乙醇胺缓冲液（DEA），0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl，pH 9.8将 0.0476 g 无水 MgCl2 和 7.359 g KCl 溶于约 300 ml 水中。溶解后加入 51 ml 二乙醇胺（99.5%）。用 6 M HCl 调节 pH 至 9.8。用水定容至 500 ml。
硼酸盐缓冲液，0.1 M，pH 9.5将 3.09 g H3BO3 溶于约 300 ml 蒸馏水中；用 NaOH 和/或 HCl（6 M 或更低浓度）调节 pH 至 9.5。用蒸馏水定容至 500 ml。
TRIS 缓冲液，0.2 M，pH 8.5将 3.85 g 三（羟甲基）氨基甲烷溶于 100 ml 水中。用 NaOH 和/或 HCl（6 M 或更低浓度）调节 pH 至 8.5。用水定容至 200 ml。
TRIS 缓冲液 + BSA 溶液（0.1%），pH 8.4将 0.050 g BSA 溶于 50 ml TRIS 缓冲液（pH 8.4）中。该溶液必须在使用当天新鲜配制。
PBS 缓冲液 + TWEEN® 0.05%将 0.250 g TWEEN 20 溶于 500 ml 已配制好的 PBS 缓冲液（pH 7.4）中
PBS 缓冲液 + BSA 溶液 0.1%将 0.050 g BSA 溶于 50 ml PBS 缓冲液（pH 7.3）中。该溶液必须在使用当天新鲜配制。
PBS 缓冲液 + BSA 0.1% + NaN3 0.02%将 0.050 g BSA 和 0.010 g NaN3 溶于 50 ml PBS 缓冲液（pH 7.3）中。储存溶液
酶底物溶液将 0.010 g 1-萘基磷酸钠盐溶于 100 ml DEA 缓冲液（pH 9.8）中。用铝箔严密包裹容器。该溶液必须在使用当天新鲜配制。
脱脂奶粉封闭液将 0.20 g Blotting Grade Blocker 无脂干奶粉（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）加入 200 ml PBS 缓冲液（pH 7.3）中。该溶液必须在使用当天新鲜配制。
HT-2 储备液将 10 mg HT-2 毒素安瓿瓶内容物溶于 10 ml 乙腈中，得到浓度为 1 mg/ml 的溶液。将此溶液分装为每份 30 ml 的单次使用 aliquot，储存于 -30 °C 以下。
HT-2 工作标准液取 20 ml HT-2 毒素储备液，转移至 2 ml 容量瓶中，用乙腈定容，得到含 10 μg/ml 芪类毒素的 HT-2 工作液。该溶液应在使用当天新鲜配制。
HT-2 工作校准液将 HT-2 工作标准液（10 μg/ml）稀释，配制 100 ng/ml 的工作校准液。再将 100 ng/ml 的 HT-2 工作校准液进一步稀释，配制以下浓度的工作校准液：0（空白）、0.5、1、2、4、10 ng/ml。这些溶液必须在使用当天新鲜配制。
HT-2 与 KLH 偶联物将 HT-2 与 KLH（钥孔血蓝蛋白）偶联物储备液（1 mg/ml PBS）分装为每份 350 μl 的单次使用 aliquot。将 aliquot 储存于 -30 °C。
特异性单克隆抗体将单克隆抗体储备液（1.383 mg/ml）用 PBS 按 1:350（v:v）稀释，用于竞争步骤。该溶液必须在使用时新鲜配制。10 ml 抗体储备液（PBS 中）可稀释至终体积 3.5 ml，足够分析 17 个标准品和/或样品。
标记二抗将碱性磷酸酶标记的抗小鼠 IgG（H+L）用 PBS 按 1:100（v:v）稀释，用于竞争步骤。100 μl 抗体储备液（PBS 中）稀释至终体积 10 ml，足够分析 25 个标准品和/或样品。该溶液必须在使用时新鲜配制。
磁性粒子浓缩器：MPC®-SInvitrogen
PalmSens 仪器PalmSens配备 PalmSens Lite、连接 PC 笔记本电脑的串行电缆及 Mux 选项软件
CH8 PalmSens 多路复用器PalmSens
八通道 Mux 电接触装置手工制作
八通道丝网印刷电极（SPE）条带手工制作
电极条带专用支架手工制作。包含 8 块钕磁铁，每块磁铁位于 SPE 的每个工作电极表面下方
校准微量移液器Gilson, Inc.
磁力搅拌器及搅拌子
玻璃烧杯（100、50、20 ml）
容量瓶（2 ml）
0.2 和 2 ml Eppendorf 管Eppendorf
5 ml 和 15 ml Falcon 管Falcon BD
实验室涡旋混合器避免使用涡旋混合器重悬 HT2-KLH 包被或与免疫链连接的磁珠，以防蛋白质部分变性
实验室烘箱或恒温房间选择可维持 37±3 °C 温度的烘箱。

参考文献

  1. Koch, P. State of the art of trichothecenes analysis. Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).
  2. Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals. Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).
  3. Morozova, T. Y., Morozov, V. N. Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads. Anal. Biochem. , 263-271 (2008).
  4. FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, , Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).
  5. Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study. Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).
  6. Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
  7. Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis. Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).

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