使用 Gene Pulser MXcell 电穿孔系统高效转染原代细胞

摘要

本实验方案展示了如何使用 Gene Pulser MXcell 电穿孔系统快速、简便地确定小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）或其他原代细胞的最佳电穿孔条件。相关视频中还讨论了故障排除时的注意事项。

摘要

电穿孔正日益显现出其作为将质粒DNA或siRNA导入原代细胞最有效方法的优势。Gene Pulser MXcell电穿孔系统与Gene Pulser电穿孔缓冲液（Bio-Rad）专为高效转染核酸进入哺乳动物细胞以及难转染细胞（如原代细胞和干细胞）而开发。我们将演示如何开展一项简单的实验，以快速确定最佳电穿孔条件。我们将展示如何同时对多个样品在一系列不同电穿孔条件下进行处理，从而在优化条件的同时完成正式实验。我们还将说明如何将使用96孔电穿孔板所确定的最佳条件应用于标准电穿孔杯，实现在保持相同电穿孔效率的前提下，从电穿孔板顺利过渡到电穿孔杯。在视频中，我们还将讨论影响电穿孔实验成功或失败的一些关键因素。

方案

1）细胞制备

1. 使用贴壁细胞时，必须在电穿孔前进行胰蛋白酶消化并收集细胞。
2. 为了比较代表三个不同传代次数的四种小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养物之间的转染效果，对每个培养瓶执行以下操作。
3. 吸除细胞培养基。
4. 加入 PBS 洗涤细胞。
5. 移除 PBS，加入足量胰蛋白酶覆盖细胞，并等待数分钟使胰蛋白酶发挥作用以使细胞脱落。
6. 在显微镜下检查培养瓶以确认细胞状态，轻拍培养瓶促进细胞脱落，然后再次检查以确保所有细胞均已脱落。
7. 如必要，延长孵育时间并重复操作。
8. 待所有细胞脱落后，加入含血清的培养基以中和胰蛋白酶。
9. 将细胞转移至离心管中，通过离心（相对离心力 = 300 × g）收集细胞沉淀。
10. 移除上清液，并将细胞重悬于已知体积的 PBS 中。
11. 计数细胞。
12. 转移适量体积的细胞悬液至新管中，以提供实验所需数量的细胞（每孔需要 150 μL 细胞悬液，细胞密度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL）。
13. 离心细胞。
14. 移除上清液，并将细胞重悬于适量体积的 Gene Pulser 电穿孔缓冲液中，使细胞密度达到 1 × 10⁶ 个细胞/mL。
15. 每毫升细胞悬液中加入 20 μg 质粒 DNA，并轻轻混匀。

2）电穿孔装置设置与电穿孔

培养板设置与电穿孔

1. 将电穿孔板插入 Gene Pulser MXcell 电穿孔系统的电源模块中。
2. 用移液器将 150 μL 细胞混合液或缓冲液加入 96 孔电穿孔板的各孔中。
3. 将板放入板室并进行电脉冲。
4. 从室中取出电穿孔板。
5. 通过在每个孔中反复吹打混匀孔内溶液。
6. 将各孔中的细胞转移至 12 孔板的预温缓冲液中。
7. 轻敲培养板使细胞分布均匀，并将板放入培养箱中。
8. 让细胞恢复培养 24 小时。

比色皿设置与电穿孔

9. 从 Gene Pulser MXcell 电穿孔系统电源模块上拔下培养板腔室，插入 ShockPod™ 电转杯腔室。
10. 将 600 μL 细胞悬液移入 0.4 cm 间隙的电穿孔电转杯中。
11. 将电转杯放入 ShockPod 腔室，并施加电脉冲。
12. 从腔室中取出电转杯。
13. 通过在电转杯中反复吹打混合其内容物。
14. 将每个孔中的细胞转移至 12 孔板中预热的缓冲液中。
15. 轻敲培养板以分散细胞，并将培养板放入培养箱。
16. 让细胞恢复培养 24 小时。

3) 代表性结果

转染细胞并使其恢复后，使用落射荧光显微镜定性分析转染效率，并通过流式细胞术进行定量分析。

图1. 已成功进行电穿孔并正在表达GFP基因的细胞在落射荧光显微镜下可见。

图2. 通过相差显微镜观察可同时看到转染与未转染的细胞。这些细胞接受了最低电压的电穿孔脉冲处理，电压为200V。由于细胞密度较高，细胞已基本汇合。

图3. 同一视野在落射荧光下显示有部分细胞表达GFP标记，但这些细胞仅占前一张图像中可见细胞的一小部分。

图4. 在250V下，相差显微镜下观察到的活细胞总数略有减少。

图 5. 在落射荧光显微镜下可见，表达 GFP 的细胞数量有所增加。

图6. 在施加最高电压375 V时，可见的活细胞数量较少。

图7. 然而，剩余细胞中有很大比例表达GFP。最佳条件取决于实验设计：在某些实验中，转染细胞数量最多可能最为理想，而在其他实验中，转染百分比最高可能更优。

我们关注在每种条件下GFP阳性细胞所占的百分比，以及该百分比如何随细胞年龄变化。流式细胞术可提供不同电穿孔条件下转染结果的定量信息。

图8. 本图显示了在12种电穿孔条件下，第5代细胞中GFP阳性细胞所占的百分比。在最高电压的指数衰减脉冲（条件6）下，转染效率最高，约为80%；在测试的最强方波脉冲（条件12）下，转染效率为70%。

图9. 在电穿孔前传代9次的细胞中，转染百分比的整体模式几乎相同，但转染百分比略有下降。

图10. 此处显示的是第13代细胞中GFP阳性细胞的百分比，相较于较年轻的细胞，其转染效率显著下降。最高转染效率仅约为较年轻细胞的一半，表明应尽可能在细胞分离后尽早使用健康的细胞。

使用 Gene Pulser MXcell 转染 MEF 细胞所用的电穿孔条件
条件 (1-6) 指数衰减脉冲， 均使用 350 uF、1000 ohm	电压 (V)
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
条件 (7-12) 方波脉冲， 均使用 2000 uF、1000 ohm 和 1 次脉冲	电压 (V)	脉冲持续时间 (ms)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

讨论

本视频文章演示了如何使用 MXcell 电穿孔系统，简便地确定 MEF 或其他原代细胞系的最佳电穿孔条件。96 孔板格式可同时进行大量实验或优化条件的重复操作，从而避免开展多次独立实验。在操作过程中，应注意尽可能在细胞分离后尽早使用状态健康的细胞，并选择与电穿孔缓冲液相匹配的电穿孔条件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gene Pulser® 电穿孔缓冲液	Bio-Rad	165-2676
Gene Pulser MXcell™ 电穿孔系统	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser MXcell™ 配套 ShockPod™ 电穿孔杯室	Bio-Rad	165-2673
配备 ShockPod™ 电穿孔杯室的 Gene Pulser MXcell™ 电穿孔系统	Bio-Rad	165-2674