一种用于评估小脑性共济失调小鼠模型的简易复合表型评分系统

摘要

我们描述了一种用于快速且灵敏地定量小鼠小脑性共济失调疾病严重程度的实验方案。检测指标包括后肢抓握、 ledge test（ ledge 测试）、步态和脊柱后凸。该方案能够有效区分患病个体与非患病个体，并能检测患病个体随时间推移的病情进展。

摘要

我们描述了一种用于快速且灵敏地量化小鼠小脑性共济失调疾病严重程度的实验方案。该方案基于先前在多种疾病模型中发表的表型评估方法，包括脊髓小脑性共济失调、亨廷顿病和脊髓延髓肌萎缩症。评估指标包括后肢抓握、 ledge test（ ledge 试验）、步态和脊柱后凸。每项指标均采用0-3分的评分标准，四项总分合计为0-12分。该评分系统可有效区分患病与非患病个体，同时能够量化神经退行性疾病的表型随时间的进展。各指标可单独分析，也可合并为综合表型评分以提高统计效能。四种指标的最佳组合取决于具体研究的疾病类型。本文以脊髓小脑性共济失调7型（SCA7）转基因小鼠模型为例，展示了该方案在评估疾病严重程度中的应用。

Albert R. La Spada 和 Gwenn A. Garden 对本稿件的贡献相同。

方案

为避免偏倚，进行评估的实验人员应不知晓动物的基因型。各项指标均采用0-3分制进行评分，其中0分表示无相关表型，3分表示表型最为严重。每项测试均需重复多次，以确保评分结果具有可重复性。肥胖将影响所有所述指标的解读。研究者可在表型评分后对小鼠进行称重，以评估脂肪含量对结果的可能影响。

Ledge 测试

Ledge实验是评估协调功能的直接方法，小脑性共济失调及许多其他神经退行性疾病均会导致协调功能受损。该指标与人类小脑性共济失调的临床表现最为接近。

1. 将小鼠从笼中提起，放置于笼子的边缘。小鼠通常会沿着边缘行走，并试图返回笼内。
2. 观察小鼠沿笼边行走并降低身体进入笼内的过程。野生型小鼠通常能平稳地沿边缘行走而不失去平衡，并利用前爪协调地将自己降回笼中，此情况记为0分。若小鼠在沿边缘行走时失去立足点，但整体动作仍具协调性，则记为1分。若其后肢使用明显不充分，或在进入笼内时头部着地而非前爪着地，则记为2分。若小鼠在行走或试图下降过程中从边缘跌落或近乎跌落，或出现颤抖且尽管受到鼓励仍拒绝移动，则记为3分。部分小鼠可能需要轻微推动以鼓励其沿边缘行走或返回笼中。
3. 记录 ledge test 评分。

后肢抓握

后肢抓握是多种神经退行性疾病小鼠模型中疾病进展的标志，包括某些小脑性共济失调[1]。

1. 抓住小鼠尾部靠近基部的位置，将其提起，使其完全脱离周围所有物体。
2. 观察后肢位置持续 10 秒。如果后肢持续向外伸展，远离腹部，则评分为 0 分；如果在悬吊期间超过 50% 的时间内有一侧后肢向腹部回缩，则评分为 1 分；如果在悬吊期间超过 50% 的时间内双侧后肢均部分回缩向腹部，则评分为 2 分；如果在悬吊期间超过 50% 的时间内后肢完全回缩并接触腹部，则评分为 3 分。
3. 将小鼠放回笼中，并记录其后肢抓握评分。

步态

步态是协调性和肌肉功能的一种衡量指标。

1. 将小鼠从笼中取出，放置于平坦表面，使其头部朝向远离实验人员的方向。
2. 从后方观察小鼠行走。若小鼠行走正常，四肢均匀承重，腹部不接触地面，双侧后肢运动对称，则评分为0分；若行走时出现震颤或跛行现象，则评分为1分；若出现明显震颤、严重跛行、骨盆下垂或行走时足部外展（“鸭步”），则评分为2分；若小鼠前移困难，腹部拖行于地面，则评分为3分。
3. 将小鼠放回笼中，并记录其步态评分。

脊柱后凸

后凸畸形是脊柱的一种特征性背侧弯曲，常见于小鼠模型的神经退行性疾病表现中[2]。其病因是神经退行性变继发的脊柱肌肉张力丧失。

1. 将小鼠从笼中取出，放置于平坦的表面上。
2. 观察其行走状态。若小鼠行走时能够轻松伸直脊柱，且无持续性驼背，则评分为0分；若小鼠表现出轻度驼背但能够伸直脊柱，则评分为1分；若小鼠无法完全伸直脊柱，并持续存在但程度较轻的驼背，则评分为2分；若小鼠在行走或静坐时均表现出明显的驼背，则评分为3分。
3. 将小鼠放回笼中，并记录其驼背评分。

代表性结果

在动物数量充足的情况下，该方法能够检测不同品系之间以及同一品系随时间变化的表型差异。进行数据分析时，通过计算每个个体三项测量值的平均值来获得每项指标的评分。各项指标可单独分析，也可合并为每个个体的综合表型评分。

绘制数据图表，并应用适当的统计学方法以确定显著性。图1展示了小鼠转基因SCA7模型的复合表型评估结果。在此条件性敲除SCA7-92Q转基因模型中，含92个CAG重复序列的人类ataxin-7基因两侧被loxP位点包围，并由细菌人工染色体驱动表达。复合表型评分包括抓握、横杆行走、步态和脊柱后凸评估，最高得分为12分。随着复合表型评分的逐渐升高，表明该条件性敲除SCA7-92Q转基因小鼠呈现出进行性SCA7表型，这与人类疾病的进行性特征一致。

图1. 条件性敲除SCA7-92Q小鼠在20周龄时开始表现出进行性SCA7表型，该表型与非转基因同窝小鼠存在显著差异（双因素方差分析：Bonferroni） 事后；***P<0.001）。对小鼠的 ledge 实验、抓握、步态和脊柱后凸分别采用 0-3 分制进行评估。计算每种基因型在各年龄的平均综合评分。柱状图表示标准误（SEM）。

讨论

本方案旨在对小脑性共济失调小鼠模型的疾病严重程度进行灵敏且易于操作的评估。评分系统中的各个组成部分在不同的神经退行性疾病小鼠模型中可能具有不同程度的有效性。

该评分系统的各个组成部分已被有效用于评估多种人类神经退行性疾病的小鼠模型，包括小脑性共济失调、亨廷顿病和脊髓延髓肌萎缩症[1-3]。针对不同疾病，理想的测试组合会有所不同。本方案最初由作者设计，用于评估脊髓小脑性共济失调7型（SCA7）的转基因小鼠模型。

在用于生成本研究数据的SAC7模型中，动物在40至43周龄时被处死，或在行为异常进展至动物无法自主维持营养和水分摄入的阶段时提前处死。