利用 in ovo 电穿孔技术解析鸡胚神经管中遗传定义神经元群体的轴突通路

摘要

本视频演示了如何利用在特定增强子元件调控下通过in ovo电穿孔将报告基因导入鸡胚脊髓中遗传学定义的神经元群体，以可视化其轴突投射通路。

摘要

利用增强子元件驱动报告基因在神经元中的表达，是追踪轴突投射的常用范式。在脊椎动物中追踪脊髓中间神经元的轴突投射时，通过生殖系靶向的报告基因通常会产生双侧对称的标记，因此难以区分同侧与对侧投射的轴突。对鸡胚神经管进行单侧电穿孔，可有效将报告基因的表达限制在中枢神经系统的一侧，从而实现对两侧轴突投射的追踪。^{1 ,2-5}. 本视频首先演示了注射前如何处理鸡胚卵。在 Hamburger-Hamilton（HH）18-20 期时，将 DNA 注射至神经管的骶段，随后将钨电极平行置于胚胎两侧，通过脉冲发生器施加短暂的电脉冲。注射后的卵用胶带密封，并放回孵育箱中继续发育。三天后（E6），从胚胎中取出脊髓，制备成“开放式书页”结构，固定后进行整体免疫抗体染色。染色后的脊髓组织置于载玻片上，利用共聚焦显微镜观察成像。

方案

一、电穿孔

卵的处理

1. 将鸡蛋置于设定为37-38°C的加湿培养箱中孵育，最好使用带有摇摆托盘的培养箱。
2. 孵育约66小时后，当胚胎发育至Hamburger & Hamilton（HH）18-20期时进行电穿孔。在此阶段，头部与躯干呈直角（称为颈弯曲），并可见大量胚外血管结构，如前、后、右侧及左侧卵黄静脉。此时期是依赖增强子实现特异性表达的最佳阶段^1,3,4。为获得存活且发育同步的胚胎，必须严格监控培养箱内的温度和湿度。
3. 孵育66小时后，从培养箱中取出鸡蛋，水平放置，静置5-10分钟，此时胚胎位于蛋的上极。

准备工作

1. 制备含青霉素/链霉素（P/S）的 Hank's 溶液（1:100 稀释）。
2. 将玻璃毛细管（直径 0.5 mm）拉制成微毛细管。
3. 将电极（钨丝）安装至显微操作器，并将电极连接至脉冲发生器（ECM 830）。
4. 设置脉冲发生器参数如下：电压 30 V，脉冲次数 3 次，脉冲时长 50 ms。
5. 准备口吸管、注射器针头和胶带。
6. 配制所需浓度的 DNA 混合液（2–5 μg/μl），并加入快绿染料。

窗化与电穿孔

1. 使用注射器从每个鸡蛋中吸取 5–6 ml 的白蛋白。
2. 用小剪刀在鸡蛋的上部打开一个椭圆形窗口。
3. 用 0.5–1 ml 的 Hank's + P/S 溶液润湿胚胎。
4. 使用口吸移液管将 DNA 混合物吸入玻璃微毛细管中。
5. 将胚胎尾部朝向操作者放置。在此阶段，胚胎的脊髓清晰可见，因此无需使用任何对比增强技术。脊髓在头端和尾端均封闭，但如果微毛细管足够细，即可以较小角度刺入神经管并穿透其中。合适直径的微毛细管应能轻松吸入 DNA，穿透神经管时不造成损伤，并可通过平稳呼气将 DNA 释放。
6. 使用口吸移液管注入 DNA。绿色染料应从尾尖扩散至发育中的脑泡区域。
7. 将电极平行放置于神经管两侧，尽量靠近但不要接触神经管本身，然后施加电脉冲。施加脉冲时，电极必须被液体覆盖以保证电导性。通常，最初加入的 Hank's 溶液量已足够；若不足，可在电脉冲前再添加一滴 Hank's 溶液。
8. 小心移除电极，并用胶带密封窗口。必须完全密封鸡蛋，以防止在后续孵育过程中胚胎干燥。
9. 将鸡蛋放回孵育箱中。

II. 脊髓开放式制备

将脊髓从胚胎中分离

1. 在E6时期，从鸡蛋中取出电穿孔后的胚胎，并将其放入涂有硅胶并含有PBS的培养皿中。
2. 切除膜结构，并用大头针将胚胎腹侧展开并固定。
3. 使用锋利的钨制微毛细管，从后脑至尾部沿顶板做一条纵向切口。
4. 在脊髓两侧额外各做一条纵向切口，将背根神经节（DRGs）从脊髓上分离。
5. 从尾部开始向后脑方向将底板从组织上分离，保持脊髓完整。
6. 使用精细剪刀在后脑处对脊髓进行横切，并将其从身体上分离。

固定

1. 将分离的脊髓置于一个新的涂有硅胶并含有 PBS 的培养皿中，用固定针从后脑至尾部将其展开，制成平铺标本。
2. 倒掉培养皿中的 PBS，加入含 4% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲液。
3. 在室温下孵育 1 小时。

免疫组织化学

1. 将固定的脊髓转移至含有PBS中一抗的离心管中。
2. 在4°C下轻轻振荡孵育过夜。
3. 用PBS洗涤抗体5次，每次洗涤1小时，期间轻轻振荡。
4. 加入二抗，在4°C下轻轻振荡孵育过夜。
5. 用PBS洗涤抗体5次，每次洗涤1小时，期间轻轻振荡。

用于成像的开放式样本固定

1. 在载玻片上涂抹呈矩形的润滑脂或硅脂，并在其中滴加 PBS。
2. 用镊子将脊髓置于矩形中央并拉直，用巴斯德吸管吸除其周围的液体。
3. 在脊髓上滴加 1–2 滴封片介质，盖上盖玻片，轻轻压平以避免产生气泡。
4. 将载玻片置于 4°C 避光保存。
5. 使用共聚焦显微镜观察脊髓组织。

讨论

将质粒DNA电穿孔导入鸡胚已成为一种强大的体内异位表达技术。结合特定增强子与鸡胚电穿孔技术，可快速高效地解析由特定基因定义的神经元群体的轴突投射通路^1,3,5。利用Cre/LoxP和Gal4/UAS扩增系统，可增强基因表达水平并延长表达时间。目前的研究表明，不同中间神经元亚群因其轴突投射方向不同，可产生复杂的轴突导向信号分化。此外，还可同时实现对两种神经元群体的分子特异性和空间限制性标记，从而提供有关神经环路结构的信息³。