利用鸡胚神经管破译基因定义的组的神经元轴突途径在OVO电穿孔

Summary

本视频演示了如何进行可视化基因定义组在鸡胚脊髓利用线中的神经元轴突途径在OVO电记者基因特定的增强子元件的控制下。

Abstract

增强子驱动报告基因的表达在神经元的就业是一个广泛使用的范式跟踪轴突投射。轴突投射，在脊椎动物的脊髓interneurons跟踪，生殖系有针对性的记者基因产生双边对称的标签。因此，它是很难区分的IPSI和禁忌横向预测轴突。单方面电到鸡胚神经管提供了有益的手段限制记者基因表达的中枢神经系统的一侧，并按照双方的轴突投射

Protocol

一，电穿孔

蛋处理

1. 37-38 ° C，最好的孵化器与一个摇摆托盘放置在培养箱集蛋。
2. 胚胎电穿孔后的潜伏期约66小时，当他们到达汉堡和汉密尔顿（HH）阶段18-20。在这个阶段，头部直角在于主干（称为颈椎弯曲的条件）和一个广阔的设置，如前，后，左，右卵黄静脉应被视为额外的胚胎血管。这是一个依赖增强的具体体现^1,3,4的最佳阶段。重要的是要监测温度和湿度的孵化器，以获得可行的和同步的胚胎。
3. 经过66小时的孵化，从孵化器中取出的鸡蛋。横向放置鸡蛋。等待5-10分钟。现在的胚胎是坐落在鸡蛋上极。

筹备工作

1. 准备汉克的青霉素/链霉素（P / S）（1:100稀释）的解决方案。
2. 拉玻璃毛细管（直径0.5毫米），以microcapillary。
3. 放入显微电极（钨）和连接电极的脉冲发生器（流脑830）。
4. 调整以下参数:电压30V的脉冲发生器，脉冲数 - 3，脉搏50毫秒的长度。
5. 准备一个口吸管，注射器针头和磁带。
6. 准备所需的DNA（2-5μg/μl）混合，并添加了一个快速的绿色染料。

窗口和电

1. 用注射器从每个鸡蛋中删除5-6毫升白蛋白。
2. 用小剪刀打开一个椭圆形的窗口，在蛋的上部。
3. 湿润胚胎0.51毫升汉克+的P / S解决方案。
4. 使用口吸管，装载玻璃microcapillary DNA混合物。
5. 将其对你的尾巴的胚胎。在这个阶段，可以清楚地看到胎儿的脊髓。因此，没有对比技术是必需的。脊髓密封两端，头部和尾巴，但如果你microcapillary是够薄，你会被刺穿了一个小洞，能够渗透神经管在浅层的角度。应装入一个正确的直径microcapillary容易与DNA，渗透管，而不破坏它和释放的DNA与一个定期呼气。
6. 使用口吸液管注入DNA。绿色染料蔓延，从尾巴尖发育中的大脑的囊泡。
7. 电极放置在平行神经管，为附近就可以了，而不触及管和脉冲。脉冲时间，电极必须与液体覆盖，使导电。通常情况下，汉克的乞讨添加的量是足够的的。如果不加一滴汉克的前脉冲。
8. 小心地取出电极，并用胶带密封的窗口。重要的是完全密封的鸡蛋，以防止干燥过程中的胚胎以下的潜伏期。
9. 将鸡蛋在孵化器的背面。

二。脊髓开卷准备

从胚胎的脊髓支队

1. 取出eletroporated胚胎，在E6，从鸡蛋，放入含有PBS硅涂层的培养皿中。
2. 切去膜和拉伸他的腹侧方用针举行的胚胎。
3. 使用锋利的钨microcapillary一纵形切口，从后脑下来的尾巴，使沿顶板。
4. 脊髓两侧，另外两个纵向切口，分离远离脊髓背根神经节（病种付费）。
5. 从尾部开始向后脑组织分离的底板，使脊髓完好。
6. 在后脑用细剪刀剪下一个横截面的脊髓和身体分开。

固定

1. 涂硅含PBS中，用针举行，从后脑到尾巴生产平面安装准备在一个新的培养皿菜分散孤立的脊髓。
2. 从菜倒入PBS和4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液代替。
3. 室温孵育1小时。

免疫组织化学

1. 固定脊髓转移到一个包含在PBS的主要抗体的小瓶。
2. 4孵育过夜的温柔鼓动° C。
3. 洗X5的抗体，用PBS次，每次1小时温柔的鼓动洗。
4. 新增二级抗体孵育过夜的温柔鼓动4 ° C。
5. 用PBS清洗抗体X5次，每次1小时，用温和的鼓动。

安装成像开卷

1. 涂抹油脂或有机硅在幻灯片上的矩形形状和滴灌PBS内。
2. 放置在使用镊子的矩形，并绘制出它周围的液体与巴斯德吸管中间伸脊髓。
3. 对脊髓1-2滴的安装介质，并盖上盖玻片。壁球，以避免气泡。
4. 在黑暗的幻灯片保持在4 ° C
5. 使用共聚焦显微镜检查脊髓。

Discussion

作为一个强大的技术，在体内的异位表达质粒DNA进入鸡胚电穿孔的发展。具体的促进剂，和小鸡电的结合提供了一个快速和有效的工具，破译基因定义组^的神经元1,3,5轴突途径。利用CRE / LoxP位Gal4/UAS放大系统，可以增加表达水平和持续时间。新兴的图片是一个轴突的线索，从中间神经亚群，其轴突预测的方向定义产生的复杂分歧。此外，同时分子和空间限制的两个神经元群体的标签可以达到。因此，提供有关的神经回路³的架构的信息。